Д. х. н. Бельтюкова С.В., Бычкова А.А., к.х.н. Малинка
Е.В.
Одесская национальная
академия пищевых технологий, Украина
Определение антиоксидантов в
растительном сырье методом твёрдофазной люминесцентной спектроскопии
Одним из важнейших показателей качества
пищевых продуктов является их антиоксидантная активность. Антиоксиданты (АО) –
вещества различной химической природы, способные тормозить или устранять
неферментативное свободнорадикальное окисление органических соединений
различными формами кислорода. К антиоксидантам относятся и полифенолы. Их биологическое
действие связано с Р-витаминной активностью флавоноидов, антимикробной – катехинов,
а весь комплекс полифенолов обладает антилучевым, антистрессовым,
антиоксидантным действием.
Хлорогеновая
кислота (ХК) – 1,3,4,5-тетрагидроксициклогексан карбоновая кислота
3-(3,4-дигидроксициннамат), является одним из самых распространенных
фенилпропаноидов среди метаболитов растений и оказывает антиоксидантное,
антиканцерогенное, противовоспалительное и анальгетическое действие [1,2]. В
больших количествах содержится в зернах кофе, листьях черники обыкновенной,
арники горной, ромашки лекарственной и других растениях. Зерна сырого кофе
содержат примерно 7-10% хлорогеновых кислот. К качеству кофе и содержанию
основных полифенолов в нем предъявляются жесткие требования. Проведение
экспертизы подлинности с целью идентификации сорта жареного молотого кофе
осуществляют по содержанию основного кислотного компонента кофейных зерен - хлорогеновой
кислоты.
Чаще
всего полифенольные компоненты растительного сырья, в том числе и хлорогеновую
кислоту определяют методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с фотодиодным матричным
детектированием, с помощью обращено-фазовой ВЭЖХ [3]. Эти методы дают
возможность одновременного обнаружения флавоноидов в лекарственных растениях,
характеризуются низкими пределами обнаружения (5-6)∙10-8моль/л.
Однако они требуют наличия достаточно дорогостоящей и сложной аппаратуры.
Нами
разработана методика сорбционно-люминесцентного определения хлорогеновой
кислоты в зернах кофе, основанная на регистрации собственной люминесценции
этого препарата в фазе сорбента, усиленной в присутствии ионов иттрия (ІІІ). Способ позволяет осуществлять
быстрый скрининг качества зерен натурального кофе.
Этанольный
раствор хлорогеновой кислоты при облучении УФ-светом ртутной лампы с λмакс.=365нм
проявляет люминесцентные свойства, но интенсивность люминесценции (Iлюм.)
невелика. Известно, что Iлюм. лиганда в некоторых случаях может
возрастать при комплексообразовании с ионами металлов, не имеющих собственного
поглощения в видимой области спектра. В
связи с этим было рассмотрено влияние на Iлюм. хлорогеновой кислоты
ионов иттрия, лантана, скандия, а также европия, тербия. Наибольшей
интенсивностью люминесценции обладают комплексы с Y (III), который и был выбран
для дальнейших исследований. Ионы Y (III) вызывают увеличение интенсивности люминесценции
хлорогеновой кислоты в этанольной среде в 2 раза.
Спектр
поглощения этанольного раствора хлорогеновой кислоты характеризуется полосой в
УФ-области спектра с λмакс.=335нм с молярным коэффициентом
поглощения ε=23500 л/см·моль, что свидетельствует об интенсивном
поглощении этим лигандом УФ-излучения. При комплексообразовании с ионом Y (III)
полоса поглощения хлорогеновой кислоты сдвигается в видимую область на 35 нм,
максимум поглощения составляет λмакс.=370нм. Батохромное
смещение максимума спектра поглощения хлорогеновой кислоты может служить
подтверждением комплексообразования с ионом Y (III). Установлено, что при
добавлении донорно-активной
добавки – триоктилфосфиноксида максимум полосы
поглощения комплекса хлорогеновой кислоты с ионами Y (III) сдвигается еще на 15
нм и составляет λмакс.=385нм, что свидетельствует об
образовании разнолигандного комплекса (рис.1).
Спектр возбуждения хлорогеновой кислоты при
комплексообразовании возрастает по интенсивности, но максимум возбуждения не
смещается и составляет 367 нм (рис. 2).
|
Рисунок 1 - Спектры поглощения ХК (1), ее комплекса с иттрием (III) (2) и разнолигандного комплекса с ТОФО (3) |
Рисунок 2 - Спектры возбуждения сорбатов ХК (1), комплексов ХК с ионами Y(III) (2), ХК с ионами Y(III) и ТОФО (3), ХК с ионами Y(III), ТОФО и Тритоном Х-100 (4) на фосфате алюминия; СХК =1∙10-4моль/л; СY =5∙10-3 моль/л |
Интенсивность люминесценции комплекса
усиливается на сорбентах. Экспериментально были выбраны сорбенты, на которых Iлюм. хлорогеновой кислоты
наибольшая. Для этого исследована сорбция комплекса на различных сорбентах:
пенополиуретане, цеолитах (СаА, NаА),
фосфате алюминия, силикагеле, сорбентах декстранового типа Sephadex.
Максимальная интенсивность люминесценции комплекса наблюдается на фосфате
алюминия. В присутствии ионов иттрия (III) на фосфате алюминия интенсивность
люминесценции хлорогеновой кислоты возрастает в 7 раз за счет того, что
возрастает жесткость молекулы и уменьшаются внутримолекулярные потери энергии
возбуждения.
Интенсивность люминесценции хлорогеновой
кислоты на сорбенте зависит от рН раствора, из которого проводится сорбция.
Сорбция проходит в интервале рН от 3 до 8,5. Максимальная Iлюм
наблюдается
при рН 5,8-6,2. Для создания оптимального значения рН в растворе использовали
4%-ный раствор уротропина.
Изучение зависимости интенсивности
люминесценции хлорогеновой кислоты от количества иттрия (III)
на фосфате алюминия показало, что наибольшая интенсивность люминесценции
наблюдается в интервале концентраций (2,5-8)·10-3 моль/л. Нами выбрана
концентрация иттрия (III) – 5∙10-3
моль/л.
Изучено влияние на люминесценцию сорбата
комплекса органических растворителей (метанол, этанол, пропанол, ацетон,
ацетонитрил, этилацетат, диоксан, диметилсульфоксид, диметилформамид);
поверхностно-активных веществ (ПАВ) различной природы (лаурилсульфат натрия,
цетилсульфат натрия, тридецилсульфат натрия, хлориды цетилпиридиния,
децилпиридиния, цетилтриметиламмония, Твин-80, Тритон Х-100); донорно-активных
веществ (триоктилфосфиноксид (ТОФО), 1,10-фенантролин, 2,2′-дипиридил,
антипирин). Установлено, что диметилсульфоксид, диметилформамид значительно
тушат интенсивность люминесценции, остальные практически не влияют на
интенсивность люминесценции комплекса. Наибольшая Iлюм. наблюдается при сорбции из этанольного и
этилацетатного растворов.
Интенсивность
люминесценции сорбата не изменяется в присутствии катионных и анионных ПАВ.
Неионное ПАВ Тритон Х-100 вызывает увеличение интенсивности люминесценции
сорбата в 2,5раза. Увеличивает интенсивность люминесценции сорбата в 2 раза добавка
триоктилфосфиноксида (ТОФО). При этом спектр люминесценции комплекса смещается
на 10 нм в сторону длинных волн и максимум люминесценции составляет λизл.=518нм.
Изучена зависимость интенсивности
люминесценции комплекса от концентрации ТОФО. Максимальная интенсивность
люминесценции наблюдается при концентрации ТОФО – 1∙10-3моль/л
и концентрации Тритон Х-100 – 0,1% .
Наблюдаемое увеличение интенсивности
люминесценции сорбата в присутствии ТОФО и Тритон Х-100 может быть обусловлено вхождением
молекул ТОФО во внутреннюю координационную сферу центрального иона – иттрия и
вытеснением гидрофильного хлорид-иона, увеличением жесткости люминесцентных
центров под влиянием предмицелл и мицелл неионогенных ПАВ. Можно предположить,
что все эти процессы приводят к гидрофобизации и дегидратации комплекса, что
способствует снижению безызлучательных потерь энергии возбуждения за счет
ОН-связей молекул воды.
Поскольку в зернах кофе доминирующими
фенилпропаноидами - производными оксикоричной кислоты наряду с хлорогеновой
кислотой являются феруловая и хинная, то с помощью метода тонкослойной
хроматографии была проведена идентификация сопутствующих кислот. На
хроматограмме были обнаружены только пятна, соответствующие хлорогеновой
кислоте (Rf 0,2), которые светились голубым светом.
На основании полученных результатов
разработана методика сорбционно-люминесцентного определения
хлорогеновой кислоты в различных сортах кофе (таблица 1). Определение проводили по методу
добавок.
Таблица
1
Результаты
определения хлорогеновой кислоты в зернах кофе
|
Сорт кофе |
Найдено,
мг/г |
Sr |
|
Espresso (Италия) |
12,4 |
0,015 |
|
Carte Noir Expresso (Франция) |
13,4 |
0,025 |
|
Jacobs (Польша) |
16,8 |
0,031 |
|
Melitta Bella Crema (Германия) |
20,8 |
0,021 |
|
Зерна сырого кофе сорта «Robusta» |
85,0 |
0,012 |
Как видно из таблицы, содержание
хлорогеновой кислоты в различных сортах кофе колеблется от 12,4 до 85,0 мг/г.
Наибольшее содержание хлорогеновой кислоты обнаружено в зернах сырого кофе
сорта «Робуста». Результаты определения проверены методом «введено-найдено» и
показана правильность разработанной методики. Предел обнаружения хлорогеновой
кислоты составляет 0,035 мкг/мл.
Предложенная методика определения
содержания хлорогеновой кислоты может быть использована для экспрессной оценки
качества кофе. В этом случае интенсивность люминесценции сорбата, полученного
из кофе и подготовленного согласно методике, можно сравнивать с эталонными
образцами, приготовленными предварительно, интенсивность люминесценции которых
сохраняется в течение 6-7 месяцев.
Литература:
1. Дейнека В.И., Хлебников В.А. Хлорогеновая кислота плодов и листьев некоторых
растений семейства Berberidaceae // Химия растительного
сырья. –– 2008. –– № 1. –– С. 57 –– 61.
2. Grace S.C.,
Logan B.A., Adams W.W. Seasonal differences in
foliar content of chlorogenic acid, a phenylpropanoid antioxidant, in Mahonia
repens // Plant Cell Environment. –– 1998. –– V. 21. –– P. 513 –– 521.
3. Olszewska M. Quantitative HPLC analysis of flavonoids and
chlorogenic acid the leaves and inflorascences of Prunus Serotina EHRH // Acta
chromatographica. –– 2007. –– № 19. –– P. 253 –– 269.