Федотовских Г.В., Аскаров М.Б., Шаймарданова Г.М., Конысбекова А.А., Старикова Т.Г.

Национальный научный медицинский центр г. Астана, Республика Казахстан

Регресс фиброза печени при трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга

Хронические диффузные заболевания печени (ХДЗП) имеют широкую распространенность и отличаются весьма неблагоприятным исходом в фиброз и цирроз органов. Как известно, последние являются следствием хронического воспаления и некроза гепатоцитов, постоянной регенерации и не сбалансированного фиброгенеза с нарушением гисто-, ангиоархитектоники органа и постоянно поддерживаемой гипоксией клеток.

По современным представлениям наиболее перспективным направлением в лечении хронических диффузных заболеваний печени является поиск путей регуляции регенерации паренхимы органа и снижения избыточного коллагеногенеза. Как медикаментозная терапия, так и клеточная трансплантация, как альтернативный метод лечения хронических гепатитов и циррозов печени, включают несколько путей коррекции печеночного фиброгенеза и усиления механизмов фибролиза. Торможение активации печеночных звездчатых клеток (ПЗК) может достигаться как опосредованным уменьшением воспалительной инфильтрации, приводящей к высвобождению ряда факторов активации ПЗК, так и прямым торможением трансформации их в активные миофибробласты. Перспективным направлением в контроле печеночного фиброза представляется применение цитокинов и антагонистов их рецепторов, что обусловлено непосредственным участием ростовых факторов на всех этапах сложного комплекса межклеточных взаимодействий в процессе фиброгенеза. И в этой связи, эффективным терапевтическим методом в лечении ХДЗП может стать клеточная трансплантация, изменяющая профиль продуцируемых цитокинов и участвующая в регуляции состояния иммунной системы.

Как показали данные литературы, использование аутологичных стволовых клеток костного мозга (СККМ) позволило в 70% случаев добиваться значимого эффекта и в 30% больных с хроническими гепатитами и циррозом получить положительной ответ умеренной степени выраженности[1]. Клеточная гепатоцитопластика гемопоэтических СККМ при лечении больных с хроническими гепатитами способствовала качественным структурным изменениям в печени, значительно снижая пролиферацию гепатоцитов и уменьшая число миофибробластов, что приводило к разрешению перисинусоидального фиброза и восстановлению нормального строения синусоидальных капилляров[2]. Совместное введение мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга с региональной перфузией перфторуглеродной эмульсии, активирующей в противовес клеткам Ито, систему моноцитарных фагоцитов способствовало восстановлению белоксинтезирующей функции печени и купированию печеночной энцефалопатии [3]. Учитывая необходимость дальнейшего выявления местных и общих регуляторных процессов, лежащих в основе патогенетических механизмов лечебного воздействия клеточной трансплантации, в цель настоящего исследования входило изучить морфологические особенности регресса фиброзной ткани цирротически измененной печени при трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга.

Материал и методы.

Материалом для морфологического исследования послужил биопсийный материал печени 5 больных с циррозом печени различного генеза, взятый до и после 2-3 трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток костного мозга. Аспирация костного мозга из гребня подвздошной кости в количестве 400 мл проводилась после полного клинико-лабораторного обследования. Биотехнологическим методом была выделена гемопоэтическая фракция стволовых клеток с последующим трансплантацией культивированием их в течение 72 часов. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток проводилась системно внутривенно в среднем в количестве до 140×10⁶ клеток.

Парафиновые срезы ткани печени окрашивались гематоксилином, эозином и по Массон-трихром. Для электронно–микроскопического исследования кусочки ткани печени фиксированы в 2,5% растворе глютаральдегида с постфиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия. Материал проведен по общепринятой методике и заключен в эпон. Полутонкие и ультратонкие срезы изготавливались на ультрамикротоме Leica. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим, азуром–2 и основным фуксином. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Срезы изучали и фотографировали в электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss).

Результаты исследования.

На фоне трансплантации аутологичных стволовых клеток наблюдалось клиническое улучшение состояния больных, нивелирование асцита, купирование кожного зуда, уменьшение холестаза, цитолиза, вторичной коагулопатии, переход функционального класса С в класс В по Чайлд-Пью.

При гистологическом светооптическом исследовании биопсийного материала печени до трансплантации СККМ структурные изменения характеризовались наличием, как правило, активного монолобулярного цирроза с выраженным разрастанием соединительной ткани и плотным инфильтратом из лимфоцитов и плазматических клеток в портальных и перипортальных трактах печени. Формировались порто-портальные и порто-центральные септы с образованием ложных долек. Воспалительная инфильтрация распространялась за пределы пограничной пластинки. В паренхиме определялось большое количество печеночных клеток в состоянии гидропической и очаговой баллонной дистрофии. На полутонких срезах портальные и перипортальные поля были склерозированы. Явления фиброза были отмечены как в перипортальной ткани, так и внутри долек в результате врастания в дольку соединительнотканных септ. Междольковая соединительная ткань и соединительнотканные прослойки характеризовались различной степенью макрофагально-плазмоцитарной инфильтрации и большим количеством пролиферирующих фибробластов. В перисинусоидальном пространстве увеличивалось количество коллагеновых волокон, наблюдалась выраженная капилляризация синусоидов с формированием тонкой соединительнотканной мембраны. Довольно часто встречались признаки жировой, реже вакуольной дистрофии гепатоцитов. Содержание гликогена было неравномерным и сниженным.

Электронномикроскопически, печеночные клетки содержали крупные ядра с ровными контурами ядерной оболочки. Конденсированный хроматин распределялся узкой полоской примаргинально. Перинуклеарное пространство узкое. Многочисленные митохондрии характеризовались зернистой дезорганизацией крист, набуханием матрикса и деструкцией. Канальцы гранулярного эндоплазматического ретикулума располагались беспорядочно. Мембраносвязанные рибосомы были десквамированы, узкие просветы заполнены хлопьевидным материалом средней электронной плотности. В цитоплазме были отмечены мелкие, частично разрушенные везикулы агранулярного эндоплазматического ретикулума и включения желчных пигментов. Жировые капли полиморфны по величине и гомогенны по плотности. Синусоидальная поверхность гепатоцитов на отдельных участках была сглажена. Вдоль нее располагалась четкая, хорошо выраженная базальная мембрана, свидетельствующая о капилляризации синусоидов. В перисинусоидальном пространстве Диссе располагались хлопьевидные массы и пучки зрелых коллагеновых фибрилл с характерной поперечной исчерченностью. Тонкие эндотелиальные клетки синусоидов печени находились в состоянии отека с резким просветлением гиалоплазмы и исчезновением органелл. Отдельные эндотелиоциты были разрушены. В пространстве Диссе были отмечены клетки Ито, миофибробласты и фибробласты с резко расширенными канальцами гранулярного эндоплазматического ретикулума, что отражало активную коллагенпродуцирующую функцию данных клеточных элементов. Часть макрофагов находилась в состоянии некроза.

После трансплантации СККМ степень воспалительной лимфоплазмоцитарной инфильтрации в портальных трактах снижалась, однако сохранялись выраженные дистрофические изменения гепатоцитов и наличие грубой волокнистой соединительной ткани в портальных трактах.

При электронномикроскопическом исследовании ткани печени гепатоциты содержали крупные ядра круглой формы с диффузным распределением гетеро- и эухроматина. Перинуклеарное пространство слегка расширено. В цитоплазме располагались многочисленные крупные митохондрии с зернисто дезорганизованным матриксом умеренной степени электронной плотности и четкими кристами. Отмечена гиперплазия канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума, в основном обвивавших наружные мембраны митохондрий или принимавших упорядоченное расположение. Часть канальцев гранулярного эндоплазматического ретикулума преобразовывалась в вакуоли агранулярного эндоплазматического ретикулума, между которыми располагались многочисленные электронноплотные розетки гранул гликогена. Синусоидальная поверхность была снабжена многочисленными длинными и тонкими микроворсинками и цитоплазматическими выростами, которые погружались в разрыхленные, фрагментированные, лизированные массы коллагеновых фибрилл, разделяя их на фрагменты и втягивая внутрь цитоплазмы. Вдоль синусоидальной поверхности в цитоплазме гепатоцитов были видны многочисленные крупные пузырьки с фрагментами разрыхленного аморфного коллагена. Здесь же располагались электронноплотные первичные лизосомы и расположенные в тесный ряд гипертрофированные митохондрии удлиненной и лопастной формы. Фагоцитарные вакуоли с коллагеновыми фибриллами были обнаружены и в цитоплазме фибробластов.

Таким образом, трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга способствовала положительной динамике клинического состояния больных циррозом печени. Весьма важным было снижение воспалительной инфильтрации, являющейся опосредованным путем торможения активации печеночных звездчатых клеток и регресса фиброзной ткани.

Литература

1. Черных Е.Р., Пальцев А.И., Старостина Н.М. и др. Аутологичные клетки костного мозга в комплексном лечении пациентов с хроническими гепатитами и циррозом печени. Гепатология.-2005.-Т1.

2. Киясов А.П., Одинцова А.Х., Гумерова А.А и др. Трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток больным хроническими гепатитами. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-2009.-Т3(1).-с.70-75.

3. Далгатов Г.Д., Зубрицкий В.Ф., Сабурина И.Н. и др. Применение клеточных и рейтингэндоваскулярных технологий в сочетании с региональной перфузией перфторуглеродной эмульсии в лечении хронических диффузных заболеваний печени. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-2009.-Т2 (4).-с.76-86.