Медицина/6. Экспериментальная и клиническая фарма­кология

 

1Кузьмина А.А., 2Шамаева С.Х., 1Васильева Л.В., 1Братчикова В.А., 1Малогулова И.Ш., 1Варфоломеева Н.А., 1Бушкова Э.А.,

1ФГАОУ ВПО «Северо-Восточный федеральный университет им.М.К.Аммосова», 2ГБУ Республики Саха (Якутия) «Республиканская больница №2-Центр экстренной медицинской помощи , Россия

 

УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ P.AERUGINOSA

В ОЖОГОВОМ ОТДЕЛЕНИИ

 

Аннотация

Исследовано 114 штаммов P.aeruginosa, выделенных из раневого отделяемого госпитализированных больных в течение двух лет (2011-2013 гг.) от пациентов ожогового отделения Государственного бюджетного учреждения Республики Саха (Якутия) «Республиканская больница №2-Центр экстренной медицинской помощи» (ГБУ РС(Я) «РБ№2-ЦЭМП). Анализ чувствительности изученных штаммов P.аeruginosa к бета-лактамным антибиотиками выявил высокие уровни устойчивости к цефтазидиму, цефепиму. При этом доля резистентных штаммов к цефтазидиму составила 45,5%, к цефепиму 42,2%. В 39,2% случаев штаммы были устойчивы к меропенему.

Ключевые слова: нозокомиальная инфекция, антибиотико-резистентность, ожоговое отделение.

 

1Kuzmina A.A., 2Shamayeva S.H., 1Vasilyeva L.V., 1Bratchikova V.A., 1Malogulova I.Sh., 1Varfolomeeva N.A., 1Bushkova E.A.

1North-Eastern Federal University,

2 State Budget Institution of the Republic of Sakha (Yakutia) “Republican Hospital №2 - Center of Emergency Medical Care”, Russia

 

ANTIMICROBIAL RESISTANCE OF THE P.AERUGINOSA NOSOCOMIAL STRAINS IN BURN UNIT

 

The 114 strains of P.aeruginosa, isolated from wound discharge of the patients, who were treated during two years (2011-2013) at the burn unit of the State Budget Institution of the Republic of Sakha (Yakutia) “Republican Hospital №2 - Center of Emergency Medical Care” (SBI RS (Y) “RH №2-CEMC”), were studied.  Analysis of antibiotic sensitivity to beta-lactam antibiotics in investigated strains of P.aeruginosa revealed high levels of resistance to Ceftazidime and Cefepime. Share of the resistant strains to Ceftazidime was 45,5%,  to Cefepime – 42,2%. In 39,2% of cases was revealed resistance to Meropenem.

Key words: nosocomial infections, antibiotic resistance, burn unit.

 

Актуальность темы. Одним из наиболее серьезных возбудителей нозокомиальной  инфекции, осложняющей течение многих гнойно-воспалительных заболеваний является Pseudomonas aeruginosa (P.аeruginosa). К особенностям этого микроорганизма относится быстрое формирование и высокий уровень устойчивости ко многим антибактериальным препаратам широкого спектра, которые обычно назначают для эмпирической терапии нозокомиальных инфекций [1]. 

Для P.aeruginosa характерны различные механизмы устойчивости – снижение проницаемости клеточной стенки для антибиотиков (снижение экспрессии поринового белка ОрrD), активное выведение антибиотика из клетки (активация систем эффлюкса), продукция отдельных сериновых β-лактамаз, обладающих карбапенемазной активностью. Однако наибольшее клиническое и эпидемиологическое значение имеет продукция приобретённых металло-b-лактамаз (МβЛ). Металло-b-лактамазы IMP и VIM гидролизуют практически все b-лактамы, включая карбапенемы, за исключением азтреонама.

Поэтому эффективное лечение инфекций, вызванных P.aeruginosa остается сложной клинической проблемой и требует адекватного микробиологического контроля и обязательного изучения их  чувствительности  in vitro [2].

Цель работы. Исследование резистентности нозокомиальных штаммов P.aeruginosa к антимикробным препаратам в ожоговом отделении.

Материалы и методы исследования. Исследовано 114 штаммов P.aeruginosa,  выделенных из раневого отделяемого госпитализированных больных в течение двух лет (2011-2013 гг.) от пациентов ожогового отделения Государственного бюджетного учреждения Республики Саха (Якутия) «Республиканская больница №2-Центр экстренной медицинской помощи» (ГБУ РС(Я) «РБ№2-ЦЭМП).

Выполнена идентификация штаммов по общепринятым методикам, согласно нормативным документам, регламентирующим работу бактериологических лабораторий, а также использовались биохимический микротест НЕФЕРМтест24 (MICROLATEST), тест-системы API (bioMerieux, Франция).

Определена чувствительность к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом на стандартизованной среде Мюллера-Хинтон  с дисками  фирмы «Bio-Rad» в соответствии со стандартами  CLSI. Контроль качества проводили и использованием контрольных штаммов P.aeruginosa ATCC 27853. 

Для обнаружения генов МβЛ VIM и IMP типов использована мультиплексная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (5 полирезистентных клинических изолятов P.aeruginosa). Исследование проводилось  в рамках проекта «Национальная программа мониторинга распространения штаммов грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих металло-ß-лактамазы в России (МЕТАЛЛ)» совместно с НИИ антимикробной химиотерапии (НИИАХ) ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России и Межрегиональной ассоциацией по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (МАКМАХ), с Научно-методическим центром антимикробной резистентности (ЦМАР).

 Идентификация амплификационных фрагментов blaVIM и blaIMP генов проводилась путем определения температур их плавления (~80°C для blaIMP и ~85°C для blaVIM) в присутствии интеркалирующего флуоресцентного красителя SYBR Green I. Дополнительно сравнивались кривые плавления опытных образцов с кривыми плавления позитивных контрольных штаммов.

Для оценки структуры интегронов, несущих гены МßЛ, использован метод ПДРФ (англ. RFLP, полиморфизм длины рестрикционных фрагментов).  Вариабельные участки интегронов I класса, амплифицированы с помощью праймеров к 5’(intI1) и 3’(qacED1 или tniC/Tn5090) консервативным последовательностям интегронов в парах с внутренними праймерами к генам blaVIM и подвергнуты рестрикции эндонуклеазой TaqI. Полученные рестрикционные профили ПЦР фрагментов сопоставлены с соответствующими профилями известных МßЛ-кодирующих интегронов, использованных в качестве контролей.

Выполнено эпидемиологическое типирование карбапенемрезистентных изолятов P.aeruginosa, с использованием мультилокусного анализа тандемных повторов (multiple-locus variable number tandem repeat analysis, MLVA). Проведена оценка количества тандемных повторов в шести VNTR-локусах (VNTR – Variable Number Tandem Repeat, тандемные повторы с переменным числом звеньев). Амплификация шести VNTR-локусов выполнена с помощью мультиплексной ПЦР (по 2 отдельные реакции для каждого изолята). Анализ размеров продуктов амплификации шести VNTS-локусов выполнен методом капиллярного электрофореза с флуоресцентной детекцией (фрагментный анализ) на автоматическом секвенаторе ABI-310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).  Кластерный анализ MLVA профилей проведен с помощью программного пакета Bionumerics v.6.6 (Applied Maths) с использованием категориальных значений длин VNTR локусов и алгоритма построения дендрограмм минимальных дистанций (Minimum Spanning Tree).

Статистическая обработка проводилась с помощью программы WHONET 5.6.

Результаты исследования. Анализ чувствительности 114 клинических изолятов P.аeruginosa показал, что 71% изолятов были наиболее чувствительны к амикацину. Высокая резистентность обнаружена к цефалоспоринам III – IV поколения  - цефтазидиму (45,5%) и цефепиму (42,2%), также к ципрофлоксацину (75%). 

Исследование антибиотикорезистентности штаммов грамотрицательных неферментирующих бактерий (НГОБ) показало, что штаммы P.aeruginosa наиболее чувствительны к амикацину (87,5%). При изучении нами резистентности штаммов P.aeruginosa к одной из высокоэффективных групп антибиотиков – карбапенемов (меропенем) выявлена низкая активность антибиотиков, 39,2% штаммов были резистентны.

На следующем этапе работы мы провели молекулярно-генетическое исследование 5 карбапенемрезистентых штаммов P.aeruginosa. У всех 5 изолятов по данным ПЦР анализа подтверждено наличие МßЛ VIM типа.

Методом ПДРФ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) установлена идентичность структуры интегронов, несущих ген МßЛ, у данных изолятов и VIM-2-кодирующего интегрона с набором генетических кассет: aacA7-blaVIM-2-dhfrB5-aacC-A5 (GenBank Acc. No. DQ52233), ранее описанного у штаммов P.aeruginosa из США, России и Норвегии.

Типирование P.аeruginosa с помощью анализа множественных тандемных повторов (MLVA) выявило, что все 5 МßЛ - позитивные штаммы P.aeruginosa являются родственными и принадлежат к единому клональному комплексу (CC235).  Этот распространённый сиквенс-тип 235 (ST235) является эпидемическим  и в настоящее время выявлен в стационарах 27 городов РФ, Беларуси и Казахстана («Национальная программа мониторинга распространения штаммов грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих металло-ß-лактамазы в России (МЕТАЛЛ)»).

Определение чувствительности МßЛ-продуцирующих 5 изолятов P.аeruginosa показало, что выделенные штаммы отличаются высокими уровнями устойчивости (100%) ко всем протестированным антибактериальным препаратам: пиперациллину, пиперациллин-тазобактаму, цефтазидиму, цефепиму, цефоперазон-сульбактаму, азтреонаму, имипенему, меропенему, дорипенему, гентамицину, нетилмицину, амикацину, ципрофлоксацину, левофлоксацину, фосфомицину. Чувствительность  изолятов выявлена  лишь к колистину и  полимиксину B.

Выводы

1.В условиях ожогового отделения РБ№2-ЦЭМП, имеет место клональное распространение суперрезистентного (XDR) штамма P. aeruginosa ST235 (VIM-2).

2.Распространение полирезистентности к антибактериальным препаратам  среди изолятов  P.аeruginosa в ожоговом отделении  РБ№2-ЦЭМП обусловлена выявлением у них одного из наиболее распространённых механизмов антибиотикорезистентности, связанных с продукцией металло-ß-лактамаз.

3.Появление полирезистентных МßЛ-продуцирующих штаммов и опасных эпидемических клонов P.аeruginosa требует  разработки  мероприятий инфекционного контроля, направленных на своевременное выявление и ограничение распространения циркуляции МßЛ-продуцирующих изолятов P.aeruginosa в подразделения больницы, а также  в другие в лечебные учреждения; введения обязательного постоянного мониторинга за антибиотикорезистентностью; эпидемиологическое маркирование карбапенемрезистентных изолятов

Литература

1.Решедько Г.К., Рябкова Е.Л., Фаращук А.Н., исследовательская группа РОСНЕТ. Неферментирующие грамотрицательные возбудители нозоко-миальных инфекций в ОРИТ России: проблемы антибиотикорезистентности. Клин Микробиол Антимикроб Химиотер. 2006; 8(3):243–259.

2.Яковлев С.В. Госпитальные инфекции, вызванные резистентными грамотрицательными микроорганизмами: клиническое значение и современные возможности терапии//Инфекции и антимикробная терапия. Т.06/№4/2004. С.16-18.