Аналіз зображень апарату культивування клітин

Федорчук М.М.1, студент; Безпалова О.Я.2, к.м.н.

1,2 ФБМІ Кафедра біомедичної інженерії НТУУ “КПІ”

Процес культивування клітин часто потребує тих чи інших цитологічних спостережень з метою контролю за станом клітинних культур. Точність та швидкість, з якою можна визначити стан розмножуваних клітин залежать від багатьох факторів в тому числі від застосування сучасних методів та засобів автоматизації розпізнавання зображень клітин та діагностики їх стану. Засобом встановлення зв’язку між зображенням клітин та їх клінічним станом є автоматизований аналіз що реалізується шляхом кластеризації зображень [2].

Сучасна фармацевтична біотехнологія при виробництві імунобіологічних лікарських засобів або активних фармацевтичних інгредієнтів таких як цитокіни, гормони, вакцини, моноклональні антитіла орієнтована на культивування еукаріотичних клітин.

При періодичному культивуванні доцільно штучно створити такий сталий стан, при якому концентрація клітин, питома швидкість росту й навколишньої клітини середовище не змінювалися б у часі. Такі умови можливі при безперервному культивуванні, коли клітини продуцента розмножуються зі швидкістю, що залежить від надходжень живильних речовин та деяких інших умов. Механізми забезпечення клітини життєво-необхідними речовинами вже є розроблені, функціонують та постійно вдосконалюються. Проте, разом з тим, при вирощувані популяцій живих клітин часто є необхідність у спостереженнях за їх розвитком, концентрацією та відповідністю іншим критеріям росту. Саме цим зумовлена актуальність дослідження.

Для корекції швидкості роботи і зниження затрат на посівний матеріал й живильні середовища застосовують механізми постійного моніторингу методом програмної обробки зображень. Зображення отримують шляхом фотографування середовища де відбувається культивація клітин. В окремих випадках для отримання зображень культуральну рідину у незначній кількості відбирають для аналізу. Фотографії культуральної рідини роблять при нейтральному освітленні (якщо це не відібрана для аналізу проба) з метою не нашкодити популяції. Далі програмно збережене зображення передається на аналіз до зовнішнього або інтегрованого засобу обробки інформації.

Діагностика стану культури на основі аналізу зображень клітин передбачає обробку значних об’ємів різноманітної інформації, яка характеризує стан та вигляд клітини. Ця інформація, як правило, має різнорідний характер, а також не тільки кількісну форму представлення, але і якісну. Відповідно клітини культури в залежності від його клінічного стану можуть мати специфічні особливості щодо таких своїх характеристик та ознак як кількість та розташування клітин, наявність структурних утворень, збереження форми, розмір клітини та розмір ядра, наявність багатоядерних клітин, співвідношення клітинно-ядерних розмірів; стан цитоплазми, її обсяг, тощо [1].

Так, при діагностиці патологічних утворень оцінюють більше десяти елементів цитологічної картини, зокрема: розмір клітин; форма клітин (форма патологічної чи пошкодженої клітини не відповідає формі нормальної клітини); ядерно-цитоплазматичне співвідношення; багатоядерність клітин; атипічність розташування ядра; розмір, форма та контур ядра.

Очевидно, що відповідний стан культури що культивується визначається значним потоком даних та множиною параметрів стану аналізованих клітин. При цьому в зображеннях досліджуваних клітин можуть бути відсутні значні фрагменти або спостерігатись суттєве зашумлення інформація. Це вказує на те, що задача кластеризації зображень клітин є складноформалізованою задачею розпізнавання образів в складних умовах, яка вимагає застосування математичних та програмних методів і засобів для її ефективного вирішення [5].

З огляду на спектр невирішених, або не до кінця вирішених завдань разом з аналізом літератури було розроблено метод автоматичного визначення кількості клітин на зображенні, та формалізовано завдання визначення їх нормальної форми.

Для алгоритмізації розпізнавання клітин на зображеннях важливо розподіляти їх за двома ознаками – за формою та за кольором. Для знаходження клітин на зображенні потрібно це зображення привести до стандартизованого вигляду. Таким виглядом є однотонний фон та однакові за кольром досліджуванні об’єкти на цьому фоні. Для аналізу та алгоритмізації обробки було обране зораження з кольоровими еукаріатичними клітинами на темному фоні (рис. 1а). Метод автоматичного визначення кількості клітин був реалізований посередництвом розпізнавання границь кожної клітини на зображенні. Границі клітини визначаються шляхом двонаправленого аналізу сусідніх пікселів на усьому зображенні. При різкій зміні кольору сусіднього пікселу поточний фарбується у один колір та визначається як крайній піксел одного кластеру (фону) а наступний до іншого (перший пікселу кластеру множини клітин). Двонаправлений аналіз в даному випадку — аналіз кожного рядку та кожного стовбчика з пікселів, при якому кожен піксел порівнюється з кожним з чотирьох до нього прилеглих.

Такий метод визначення можливий при використанні градієнту та насиченню RGB-складових кожного окремого пікселу. Це передбачає використання таких інструментів програмної розробки, що дозволяють розпізнавати та модифікувати кольорові зображення. Оскільки сам фон при такій процедурі визначення границь клітин не зазнає змін – над замкненими областями що обмежені визначеними границями можна проводити процедури підрахунку та додаткового кластерного аналізу.

Для вирішення задачі підрахунку кількості кластерів на зображенні було реалізовано два алгоритми. Перший - знаходження кластерів на усьому зображенні шляхом лінійного перерахунку усіх пікселів. Другий - видалення усіх знайдених кластерів та підрахунок тих, які за розміром можуть бути клітинами.

Знаходження кластерів на зображенні не є складною задачею і реалізовується лінійним перерахунком усіх пікселів. Кожен пікселу що не належить до кластеру який являє собою фон ідентифікується як початок кластеру, після чого починає працювати алгоритм їх класифікації та видалення. Кількість усіх відібраних кластерів підраховується та використовується для розрахунку кількості усіх клітин на досліджуваній площі.

а) б) в)

Рисунок 1: Вихідне зображення для аналізу (а), виокремлена область для розпізнавання (б) та розпізнані границі клітин (в).

Враховуючи кількість культуральної рідини що була вибрана для аналізу можна робити висновки про кількість клітин у біореакторі.

Визначення ж нормальної форми клітини реалізується як методом аналізу її форми, так і розрахунком її розміру. Розрахунок розміру був складовим елементом попереднього алгоритму, тому розглянемо аналіз форми клітини.

Клітина, в нормальному стані, має бути округлої форми. Тому для визначення її приналежності до того чи іншого стану варто проаналізувати її округлість. Аналіз округлості полягає у співставленні довжини клітини до її діаметру.

Таким чином формалізована задача ідентифікації клітини в нормальному стані зводиться до визначення границь їх розмірів та округлості які, в свою чергу, мають визначатися спеціалістом в даній області з врахуванням специфіки досліджуваної популяції.

Використані джерела:

1. Автоматизована кластеризація зображень клітин пацієнта з використанням штучного інтелекту/ Кунашев Д. И. // Вісник НТУ «ХПІ». Серія: Нові рішення в сучасних технологіях. – Х: НТУ «ХПІ», – 2013. - № 56 (1029). – С.105-112.

2. Fatma Taher, Naoufel Werghi, Hussain Al-Ahmad, Rachid Sammouda, (2012). Lung Cancer Detection by Using Artificial Neural Network and Fuzzy Clustering Methods. American Journal of Biomedical Engineering, № 2(3), 136-142.

3. Хенч Л., Джонс Д. «Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей», - М.: Техносфера, 2007. - 304 с.

4. Sharabchyev Y. T., (2007). Socio-Economic aspects and the loss of the Public health. Medytsynskye news, № 13. С.32-39.

5. Грицик В. Задача класифікації біологічних об’єктів. / В. Грицик, Н. Пелих // відп. ред. Ю. М. Рашкевич. - Л. : Видавництво Національного університету "Львівська політехніка", 2009. - 279 c.

6. National Center for Health Statistics. [Electronic resource], Access mode: http://www.cdc.gov/nchs/

7. Відкритий сайт новин у біологічних дослідженнях. [Електронний ресурс], відкритий доступ: http://www.grandbiology.com