Майданюк Т.В.

Національний технічний університет України

«Київський політехнічний інститут», Україна

ДНК – чіп технології та їх застосування

Нанотехнологія – високотехнологічна галузь, спрямована на вивчення і роботу з атомами і молекулами. Однією з сфер, в якій використовується нанобіотехнологія, є створення біочіпів.

Біочіп – це узагальнююча назва технології, яка передбачає використання невеликого за розмірами твердого носія, на якому щільно нанесена велика кількість біологічних молекул для різноманітних біохімічних тестів.

Понад 90% сучасних біочіпів розробляються з використанням ДНК. Тому саме ДНК – чіп технології мають велике значення для сучасної науки.

ДНК – чіпи або DNA – microarrays представляють собою організоване розміщення молекул ДНК на спеціальному носії. Частіше за все це пластинка зі скла, оскільки скло має низьку внутрішню флуоресценцію, воно є однорідним та інертним. Іноді використовують й інші матеріали, наприклад кремній, пластик.

Мікроскопічний розмір біочипів дозволяє розміщувати на невеликій площі величезну кількість різних молекул ДНК і зчитувати з цієї площі інформацію за допомогою флуоресцентного мікроскопа або спеціального лазерного пристрою для читання.

Виділяють 3 основних види ДНК – чіпів:

1. Синтезовані in situ олігонуклеотидні ДНК – чіпи (генні чіпи);

2. Нанесені на скло олігонуклеотидні мікрочіпи;

3. Нанесені на скло ДНК – чіпи.

Існує два підходи до синтезу та нанесення ДНК – мішеней на поверхню ДНК – чіпів: доставка та синтез in situ.

У разі застосування методів доставки мішень синтезується стандартним способом, таким як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), та пізніше наноситься на поверхню.

За допомогою методів прямого синтезу мішені створюються безпосередньо на поверхні чіпів шляхом поступового приєднання нуклеотидів до олігонуклеотидного ланцюга.

Найбільш прогресивним в синтезі ДНК – чіпів є метод синтезу олігонуклеотидів безпосередньо на поверхні чіпу шляхом поетапного додавання нуклеотидів до наростаючого кінця ланцюга. Цей напрямок більш ефективний, ніж використання попередньо синтезованих полінуклеотидів, так як припускає можливість одночасного синтезу всіх полінуклеотидів, які розташовуються на чіпі.

Переваги синтезу in situ полягають у великій щільності ДНК – мішеней, доступній ціні виготовлення чіпів високої складності, надійній ідентифікації олігонуклеотидів на ДНК – чіпах.

В основі проведення аналізу на ДНК – чіпах лежить гібридизація до мішеней на поверхні ДНК – чіпа мічених флуоресцентними барвниками молекул ДНК (проб). Проби отримують за допомогою зворотньої транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції виділеної з клітин мРНК.

Після проведення гібридизації є необхідною детекція результатів. Вона полягає у визначенні тих комірок чіпа, де відбулась гібридизація іммобілізованих на поверхні чіпа ДНК і ДНК аналізованої послідовності.

Оскільки кожна комірка чіпа містить ДНК мішень однієї певної послідовності, то її гібридизація з аналізованою ДНК однозначно вказує на наявність у складі аналізованої послідовності ДНК комплементарної послідовності ДНК мішені, розташованої в цій комірці.

Фактично, визначення комірок чіпа, в яких відбулася гібридизація іммобілізованих в ній ДНК проб з аналізованою ДНК послідовністю полягає у визначенні наявності в комірці аналізованої ДНК.

Для визначення аналізованої ДНК вона повинна бути міченою. Відмінність методів, що використовуються для детекції результатів, полягає в типі використовуваної мітки.

Для детекції інтенсивності флуоресценції кожної плями використовують апаратуру.

Рівень детекції залежить від комплементарності молекул ДНК та кількості проб. Кількісні показники, що одержуються при цьому використовують для визначення вмісту проб у досліджуваному матеріалі.

В більшості випадків кожна пляма на ДНК – чіпах містить ДНК окремого гена, тому інтенсивність плями розглядають як рівень генної експресії.

На сьогоднішній день ДНК – чіпи можна використовувати для детекції однонуклеотидного поліморфізму, генотипуванні, секвенуванні мутантних геномів, вивченні екзон-інтронної будови генів, аналізі диференційної генної експресії.

Використання ДНК – чіпів лежить в основі багатьох методів, які дозволяють виділяти, детектувати, ідентифікувати та кількісно аналізувати експресію десятків тисяч генів.

Гібридизація з олігонуклеотидними мікрочіпами служить для якісної та кількісної ідентифікації нуклеїнових кислот і для аналізу структурних варіацій в них.

Рибосоми присутні у всіх живих клітинах, а рибосомальні РНК є одними з найбільш еволюційно консервативних макромолекул.

У рибосомальних РНК існують кілька варіабельних ділянок. Відмінності в нуклеотидній послідовності цих ділянок застосовуються для ідентифікації мікроорганізмів і для простежування їх еволюції.

Розроблено ряд мікрочіпів для експресного методу ідентифікації нітрифікуючих бактерій, бактерій груп Bacillus та архебактерій.

Присутність рибосомальних РНК в клітині в кількості тисяч копій дозволяє проводити аналіз у ряді випадків без їх ампліфікації.

Олігонуклеотидні мікрочіпи є ефективним підходом для одночасної ідентифікації від десятків до тисяч генів і їх структурного аналізу, для виявлення специфічних нуклеотидних послідовностей.

ДНК – чіпи використовуються для встановлення спорідненості, визначення генетично модифікованих організмів, ранньої діагностики онкологічних захворювань.

Наявність ДНК – чіпів дозволяє дуже швидко і ефективно здійснювати безліч процедур аналізу індивідуальних організмів, що дуже важливо для різних практичних заходів і завдань.

Література:

1. Рыбалкина М. Нанотехнологии для всех. – М.: Nanotechnology News Network, 2005. – 444 с.

2. Дж. Уайтсайдс, Д. Эйглер, Р. Андерс. Нанотехнология в ближайшем десятилетии. Прогноз направления исследований/ Под. ред. М.К. Роко, Р.С. Уильямса и П.Аливисатоса. Пер. с англ. – М.: Мир, 2002. – 292 с.

3. Хартманн У. Очарование нанотехнологии/ Пер. с нем. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2008. – 173 с.

4. Campbell A.M., Heyer L.J. Discovering genomics, proteomics, and bioinformatics. CSHL Press, 2003. – 352 p.