Д. м. н. Волкова Л.В., Поздеева А.А., к.м.н. Перевозчикова Е.Н.

Филиал ФГУП НПО «Микроген» Минздрава России в г. Пермь

«Пермское НПО «Биомед»

Оценка способности клеток крови к синтезу интерферона в зависимости от длительности хранения лейкоэритромассы

Введение

Человеческий лейкоцитарный интерферон (ЧЛИ) – группа аутогенных гликопротеинов, биомеханизм действия которых связан с одновременным противовирусным и иммуномоделирующим эффектом. Интерферон (ИФН), являясь продуктом экстренной реакции организма на патоген, продуцируется макрофагами или другими антиген-представляющими клетками уже при первом контакте с патогенном [3]. Основные продуценты природного интерферона-альфа являются лейкоциты крови человека, наибольшая физиологическая активность которых отмечается в первые 24 часа с момента забора крови у донора. Срок хранения консервированной крови не должен превышать 48 часов при температуре от 2 до 8 ⁰С [4].

Цель и задачи

Цель исследования - оценить способность лейкоцитов, полученных из сырья, хранившегося с момента взятия крови до начала технологического процесса в течение (20 ± 2) и (43 ± 2) ч синтезировать ЧЛИ.

Поставленные задачи:

1. оценить жизнеспособность лейкоцитов в зависимости от длительности их хранения: (20 ± 2) и (43 ± 2) ч и количество ИФН с одного литра лейкоэритромассы (ЛЭМ).

2. оценить специфическую активность полученного ИФН.

Материалы и методы.

Объект исследования - лейкоциты донорской крови, выделенные из лейкоэритромассы, хранившейся при температуре от 2 до 8 ºС в течение (20 ± 2) и (43 ± 2) ч и синтезированный ими ЧЛИ.

Жизнеспособность выделенных лейкоцитов оценивали путем окрашивания их раствором 1% эозината натрия с последующим подсчетом последних в камере Горяева с помощью лабораторного микроскопа при 100-кратном увеличении.

Определение специфической активности проводили в асептических условиях на 96 - луночных планшетах с сформированным монослоем перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), чувствительных к интерферону-альфа с нагрузкой 200-250 тыс/мл. Культивирование клеточной линии проводили путем последовательных пассажей на питательной 199 среде (г. Москва) с добавлением сыворотки крупного рогатого скота. Инкубировали в течение 24 часов, при температуре (37,0±1,0) ⁰С в атмосфере, содержащей (5,0±0,5) % СО₂, влажности (60-70) % В качестве индикаторного вируса использовали вирус везикулярного стоматита (VSV) в дозе 100 ТЦД₅₀/0,1 мл. Через 24 часа после инкубации культуру клеток в планшетах просматривали с помощью инвертированного микроскопа при 100-кратном увеличении и оценивали степень деструкции клеток.

Оценку специфической активности ИФН проводили при появлении первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом (вирусом везикулярного стоматита) в дозе 1 ТЦД₅₀/0,1 мл. За специфическую активность принимали величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50 % лунок оказалась полностью пораженной цитопатическим действием вируса. Титр интерферона вычисляли методом Спирмена- Кербера в сравнении с международным стандартом ВОЗ [2].

Полученные данные подвергнуты статистической обработке и представлены в виде среднего значения и ошибки (M±m), показатели достоверности различий – по непарному t-критерию Стьюдента.

Основные результаты

В ходе исследования проведен сравнительный анализ 4-х серий полуфабриката ЧЛИ по показателям специфической активности и выхода полуфабриката с 1 литра лейкоэритромассы (ЛЭМ) с использованием ЛЭМ, хранившейся в течение (43 ± 2) часов и 4 серий полуфабриката с использованием ЛЭМ, хранившейся в течение (20 ± 2) часов.

Оценка жизнеспособности выделенных лейкоцитов показала снижение их количества при использовании сырья, хранившегося до начала технологического процесса в течение (43 ± 2) ч (табл.1).

Таблица 1

Сравнительный анализ синтеза ЧЛИ в зависимости от длительности хранения лейкоэритромассы (M±m)

Специфическая активность полуфабриката, МЕ/мл		Критерий Стьюдента,t	Выход полуфабриката с 1 литра ЛЭМ		Критерий Стьюдента, t
Длитель- ность хранения ЛЭМ (20 ± 2) ч	Длитель-ность хранения ЛЭМ (43 ± 2) ч		Длитель- ность хранения ЛЭМ (20 ± 2) ч	Длитель-ность хранения ЛЭМ (43 ± 2) ч
9622±548	3000±529	8,7^***	1,31±0,06	1,035±0,03	4,1^**

Установлено, что ИФН, синтезированный лейкоцитами, выделенными из сырья, хранившегося в течение (43 ± 2) ч имеет более низкие показатели специфической активности, чем препарат, синтез которого проходил не более 22 ч с момента взятия крови. Из результатов, представленных в табл.1, следует, что на синтез ИФН влияет длительность хранения лейкоэритромассы. Как видно из полученных результатов при использовании сырья, хранившегося в течение (43±2) ч, противовирусная активность снижается в 3,2 раза (критерий Стьюдента равен 8,7). Также отмечается снижение выхода полуфабриката ИФН с одного литра ЛЭМ до 1,035 (критерий Стьюдента - 4,1 по сравнению с выходом из 22 ч лейкоэритромассы).

Заключение

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что для сохранения у лейкоцитов физиологической активности важным фактором является сокращение срока между забором крови и выделением лейкоцитов. Применение лейкоэритромассы со сроком хранения более 45 ч значительно снижает количественные и качественные характеристики препарата – специфическую активность и полученный объем полуфабриката с 1 литра ЛЭМ.

На основе полученных статистически достоверных данных можно говорить о нецелесообразности использования двухсуточного сырья при производстве интерферона, так как это повлечет за собой уменьшение выхода готовой продукции.

Литература

1. Регламент производства № 04862997-58-12 «Интерферон человеческий лейкоцитарный (Интерферон альфа) лиофилизат для приготовления раствора для интраназального введения и ингаляций 1000 МЕ».

2. Методические указания. Определение специфической активности препаратов интерферона различного происхождения. ГИСК им. Тарасевича.

3. Биотехнология природного альфа-интерферона и лекарственные формы на его основе: учеб. пособие/ Л.В. Волкова. – Пермь, 2008. – 161 с.

4. Клиническая иммунология и аллергология/Под ред. Г. Лора-младшего, Т. Фишера, Д. Адельмана. Пер. с англ. - М. Практика. 2000. – 806 с.