Биологические науки/2.Структурная ботаника и биохимия растений.

К.б.н. Додонова А.Ш.

Карагандинский государственный университет им Е.А.Букетова, Казахстан

Разработка лабораторного регламента получения арглабина методом глубинного культивирования

Несмотря на высокие темпы развития производства лекарственных средств, с использованием одного или нескольких биологически активных веществ растительного происхождения, потребность в данных препаратах удовлетворяется не полностью. Это происходит из-за дефицита лекарственных трав, который объясняется снижением природных запасов ряда видов растений. Применение методов биотехнологии дает возможность получать биомассу, содержащую целевое биологически активное вещество в любом регионе и в любом количестве. Наиболее целесообразно использование глубинной технологии выращивания клеток, т.к. это позволяет использовать стандартное микробиологическое оборудование.

На базе Института фитохимии разработан и введен в клиническую практику противоопухолевый препарат «Арглабин», основу которого составляет одноименный сесквитерпеновый лактон, источником которого является эндемичное растение полынь гладкая Artemisia glabella [1]. Разработка метода получения биомассы полыни гладкой в качестве сырья для фармацевтической промышленности позволила бы решить проблему дефицита природных запасов.

Разработан лабораторный регламент получения и культивирования суспензионной культуры полыни гладкой [2] как альтернативного источника сесквитерпенового лактона арглабина, который включает в себя манипуляции, способствующие увеличению уровня синтеза целевого вещества: активизация эмбриогенеза [3] и обработка элиситорами [4].

Этап 1. Получение первичной суспензионной культуры

Для получения суспензии клеток использовалась длительно культивируемая каллусная ткань линии С95, обладающая высокими биосинтетическими способностями. Ткань помещают в 50 мл жидкой питательной среды МS с пониженным содержанием хлорида кальция – 220 мг/л, содержащей БАП – 0,5 мг/л и ИУК – 2 мг/л и культивируют при температуре 24-26оС, скорости вращения качалки - 90 оборотов в минуту в течение 20 суток.

Этап 2. Получение стабильной суспензионной культуры полыни гладкой

Производят засев инокулюмом с предыдущего этапа. Объем инокулюма должен быть не менее 10% от культивируемого объема. Культивирование производят при прежних условиях. На 12-15 сутки осуществляют пересев, отбирая агрегаты небольшого размера. Процедуру повторяют несколько раз - до 20 пассажей, добиваясь стабильного роста. Этап считается завершенным, когда получена стабильная суспензионная культура, которая представлена мелкими агрегатами и клетками относительно одинакового размера.

Этап 3. Культивирование посадочного материала

Полученную во втором этапе стабильную суспензию культивируют при условиях, указанных в этапе 1. Период перепассажа составляет 21 сутки. Этап 3 цикличен и обеспечивает посадочным материалом последующие этапы.

Этап 3. Активизация эмбриогенеза

Инокулюм с предыдущего этапа засевают в качалочные колбы со средой МS с содержанием хлорида кальция 440 мг/л, содержащей фитогормоны для эмбриогенеза: ИУК – 2 мг/л, БАП – 2 мг/л. Культивирование проводят при температуре 24-26^оС, скорости вращения качалки - 90 оборотов в минуту в течение 30 суток. Этап считается завершенным, когда суспензия состоит из крупных эмбриогенных агрегатов.

Этап 4. Засев ферментера

Крупноагрегатную эмбриогенную суспензионную культуру используют для засева ферментера, имеющего возможность освещения или стеклянные стнеки.. Объем инокулята должен составлять не менее 10% от рабочего объема ферментера. Культивирование суспензии полыни гладкой проводят при температуре 26^оС, продувке воздухом со скоростью 30 л/мин, кислотности среды – 6,0, уровне освещения 4500 люкс.

Этап 5а. Культивирование элиситора

Фитопатоген Giberella fujikori культивируется в 100 мл L-бульона при температуре 27-30^оС, в микробиологической качалке со скоростью вращения 100 оборотов в минуту в течении 5-7 суток. Этап считается завершенным, когда на мицелии появляются споры черного цвета.

Этап 5б. Сушка и приготовление элиситора

Культуру гриба стерилизуют в автоклаве для обеззараживания. Мицелий механически отделяют от культивационной среды и высушивают. Сухой мицелий со спорами истирают в ступке, 300 мг перетертого материала разводят 30 мл среды МС и повторно стерилизуют. На этом этапе взвесь элиситора готова для введения в суспензионную культуру.

Этап 5. Обработка суспензионной культуры элиситором

На 18 сутки культивирования в суспензионную культуру с соблюдением стерильных условий вводят элиситор, подготовленный на этапе 5б.

Этап 7. Фильтрация и сушка биомассы

На 30-е сутки культивирования биомассу отделяют от культуральной жидкости фильтрованием через бумажный фильтр, промывают дистиллированной водой для удаления остатков среды, помещают на фильтровальную бумагу и сушат в сушильном шкафу при температуре +50°С в течение 24 ч. Содержание целевого вещества в биомассе должно состоавлять не менее 1,2 % от сухого веса.

Литература:

1 Кагарлицкий А.Д., Адекенов С.И., Куприянов А.Н. Сесквитерпеновые лактоны растений Центрального Казахстана. Алма-Ата: Наука, 1987.-С.173-180.

2 Додонова А.Ш., Аманов С.Б., Адекенов С.М. Суспензионная культура полыни гладкой – источник сесквитерпенового лактона арглабина // Тезисы докл. III межд. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».- Москва.- 2005. – С. 80.

3 Додонова А.Ш. Активизация синтеза арглабина в суспензионной культуре полыни гладкой // Вестник Карагандинского университета.-2010.-№1(57).-С.22-26.

4 Додонова А.Ш. Влияние элиситоров – индукторов защитного ответа на вторичный метаболизм растительной клетки // Биотехнология. Теория и практика.- 2004.- № 1. – С.23-30.