Береснев А.И.¹, Квач С.В. ¹, Сивец Г.Г.², Зинченко А.И. ¹

¹Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

²Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск

СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ ИЗ

α-D-САХАРО-1-ФОСФАТОВ БАРИЯ И АЗОТИСТЫХ

ОСНОВАНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНОЙ

ПУРИННУКЛЕОЗИДФОСФОРИЛАЗЫ

При синтезе модифицированных нуклеозидов (МН) ферментативные процессы по сравнению с химическими обладают рядом известных преимуществ [1]. Наиболее часто используемыми ферментами для синтеза МН, являются нуклеозидфосфорилазы. Традиционная схема синтеза МН заключается в фосфоролитическом расщеплении в присутствии неорганического фосфата молекулы нуклеозида на азотистое основание и α-D-сахаро-1-фосфат с последующим переносом фосфорилированного сахарного остатка на другое азотистое основание с образованием соответствующего нуклеозида. Однако в некоторых случаях низкая растворимость исходных субстратов и высокая подверженность фосфоролитическому расщеплению целевого продукта приводят к снижению выхода синтезируемых соединений.

В некоторых работах описан метод ферментативного получения МН с использованием в качестве субстрата синтезированного химическим способом α-D-сахаро-1-фосфата [2, 3]. Подобный способ характеризуется высокими выходами целевых продуктов в реакционных смесях, однако недостатком такого подхода получения МН является сложность химического получения модифици-рованного α-D-сахаро-1-фосфата, в ходе которой образуется большое количество β-изомеров и пиранозных модификаций углеводного компонента.

Целью настоящей работы явилось ферментативное получение α-D-рибозо-1-фосфата и α-D-арабинозо-1-фосфата, а также синтез с использованием пуриннуклеозидфосфорилазы (Пур-НФазы) Escherichia coli различных МН с использованием в качестве субстратов полученные α-D-сахаро-1-фосфаты и модифицированные азотистые основания.

Объекты и методы исследования. В работе использовали сконструированный нами ранее штамм E. coli [4], продуцирующий гомологичную Пур-НФазу. Получение биомассы этого штамма проводили путем культивирования бактерий в двухлитровых колбах Эрленмейера, содержащих 0,5 л питательной среды (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,05 М Na₂HPO₄, 0,05 М KH₂PO₄, 0,025 М (NH₄)₂SO₄, 0,75% (w/v) глицерин, 0,075% глюкоза, 2 мМ MgCl₂ и 50 мкг/мл канамицина) при 37^оС. По достижении культуральной жидкостью оптической плотности 2,0 (λ=600 нм) в среду вносили α-D-лактозу до концентрации 0,4% и продолжали культивирование в течение 4 ч. По окончании процесса ферментации бактерии осаждали центрифугированием при 20 000 g, после чего ресуспендировали в 10 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,0) (КФБ).

Ферментативную активность ПНФазы определяли по скорости синтеза аденозина из аденина и инозина при 60°С. За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое способно образовать 1 мкмоль аденозина за 1 мин протекания реакции.

Реакционные смеси, содержащие 100 мМ гуанозин и 100 мМ арабинофуранозилгуанин, инкубировали в присутствии 100 мМ КФБ и 200 ед/мл Пур-НФазы E. coli в течение 48 ч при температуре 40°С. Синтезированные в ходе реакций α-D-рибозо-1-фосфат и α-D-арабинозо-1-фосфат выделяли известным методом [5].

В реакционные смеси, содержащие 10 мМ 6-меркаптопурин, 10 мМ 5-пропилурацил, 10 мМ 5-бутилурацил, 10 мМ 6-хлор-2-аминопурин, 10 мМ 6-О-метоксипурин и 10 мМ 6-N-фурфуриладенин, вносили полученные бариевые соли α-D-рибозо-1-фосфата и α-D-арабинозо-1-фосфата до концентрации 10 мМ и инкубировали в присутствии 100 ед/мл Пур-НФазы E. coli 1‒2 ч при 40°С. Ход реакций контролировали путем тонкослойной хроматографии на пластинах Silica gel 60F₂₅₄ (Merck, Германия), используя систему растворителей хлороформ-этанол в соотношении 4:1 (по объему). Расположение пятен субстратов и продуктов на пластине регистрировали в ультрафиолетовом свете, после чего вещества из пятен элюировали в 10 мМ КФБ. Концентрацию продуктов в элюатах определяли с помощью спектрофотометрии, используя известные коэффициенты молярной экстинкции. Спектры поглощения записывали на спектрофотометре UV-1202 фирмы «Shimadzu» (Япония).

Структуры синтезированных нуклеозидов подтверждали сравнением данных ТСХ и УФ-спектроскопии с образцами нуклеозидов, полученными ранее химическими методами, а также в отдельных случаях спектральными данными ¹H ЯМР-, УФ- и масс-спектроскопии.

Результаты и обсуждение. Общий механизм ферментативного синтеза МН с использованием в качестве субстратов бариевых солей α-D-рибозо-1-фосфата и α-D-арабинозо-1-фосфата и модифицированных азотистых оснований представлен на рисунке. Под действием Пур-НФазы происходило замещение фосфата в молекуле α-D-сахаро-1-фосфата на азотистое основание с образованием соответствующего модифицированного нуклеозида.

Рисунок – Схема синтеза модифицированных нуклеозидов

В отличие от способа получения модифицированных нуклеозидов, предложенного в работах [4, 6], в выполненной работе в реакционную смесь в качестве донора сахарного остатка вносится соответствующий α-D-сахаро-1-фосфат в виде бариевой соли. В ходе протекания реакции образующийся неорганический фосфат связывается с присутствующими в растворе ионами бария, что приводит к выпадению фосфата в осадок в виде бариевой соли. Удаление из раствора неорганического фосфата делает невозможным обратный фосфоролиз синтезируемого нуклеозида, что приводит к необратимости ферментативной реакции и практически 100%-ной конверсии исходного модифицированного азотистого основания в целевой нуклеозид. Впервые по описанной технологии с использованием ферментов (Пур-НФазы E. coli) синтезированы модифицированные нуклеозиды, представленные в таблице.

Таблица

Эффективность синтеза некоторых модифицированных

нуклеозидов

До-нор*	Акцептор	Продукт	Выход продукта, мол%
А	6-меркаптопурин	6-меркаптопуринрибозид	99,6
	5-пропилурацил	5-пропилуридин	99,3
	5-бутилурацил	5-бутилуридин	99,3
	6-хлор-2-аминопурин	6-хлор-2-аминопуринрибозид	99,4
	6-О-метоксипурин	6-О-метоксипуринрибозид	99,5
	6-N-фурфуриладенин	6-N-фурфуриладенозин	99,7
Б	6-меркаптопурин	6-меркаптопуринарабинозид	99,2
	5-пропилурацил	5-пропиларабинофуранозилурацил	99,5
	5-бутилурацил	5-бутиларабинофуранозилурацил	99,8
	6-хлор-2-аминопурин	6-хлор-2-аминопуринарабинозид	99,7
	6-О-метоксипурин	6-О-метоксипуринарабинозид	99,4
	6-N-фурфуриладенин	6-N-фурфуриларабинофуранозиладенин	99,3

* А ‒ α-D-рибозо-1-фосфат бария; Б ‒ α-D-арабинозо-1-фосфат бария

Из результатов, представленных в таблице, следует, что, помимо крайне высоких выходов целевых соединений, процедура выделения синтезированных нуклеозидов из реакционной смеси существенно упрощается, поскольку в растворе находятся только целевые продукты, в отличие от реакционных смесей, состав которых описан в работах [4, 6], где кроме целевых нуклеозидов присутствуют примеси других компонентов нуклеиновых кислот, а также неорганический фосфат.

Литература:

1. Mikhailopulo I.A., Miroshnikov A.I. Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application // Mendeleev Commun. 2011. Vol. 21. P. 57–68.

2. Horinouchi N., Kawano T., Sakai T. et al. Screening and characterization of a phosphopentomutase useful for enzymatic production of 2'-deoxyribonucleoside // New Biotechnol. 2009. Vol. 26. P. 75‒82.

3. Taverna-Porro M., Bouvier L.A., Pereira C.A. et al. Chemo-enzymatic preparation of nucleosides from furanoses // Tetrahedron Lett. 2008. Vol. 49. P. 2642–2645.

4. Квач С.В., Шахбазов А.В., Зинченко А.И., Картель Н.А. Штамм бактерий Escherichia coli – продуцент пуриннуклеозидфосфорилазы / Патент № 13127 BY, 2010.

5. Herk T., Hartog A.F., Burg A.M., Wever R. Regioselective phosphorylation of carbohydrates and various alcohols by bacterial acid phosphatases; probing the substrate specificity of the enzyme from Shigella flexneri // Adv. Synth. Catal. 2005. Vol. 347. P. 1155‒1162.

6. Krenitsky T.A., Koszalka G.W., Tuttle J.V. Purine nucleoside synthesis an efficient method employing nucleoside phosphorylases // Biochemistry. 1981. Vol. 20. P. 3615‒3621.