Береснев А

Береснев А.И.¹, Квач С.В.¹, Сивец Г.Г.², Зинченко А.И.¹

¹Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

²Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск

ПОЛУЧЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Все чаще появляются опубликованные работы, описывающие технологии получения новых представителей класса модифицированных нуклеозидов, находящих широкое применение при терапии злокачественных новообразований и вирусных инфекций. Каноническими методами синтеза модифицированных нуклеозидов считаются химические. Однако в последние годы преобладают публикации, описывающие синтез модифицированных нуклеозидов с использованием ферментов микроорганизмов.

Традиционными биокатализаторами, использующимися для ферментативного синтеза модифицированных нуклеозидов, служат нуклеозидфосфорилазы, катализирующие расщепление молекулы нуклеозида в присутствии неорганического фосфата (Р_i) на азотистое основание и α-D-пентофуранозо-1-фосфат [1].

Ранее нами, а также другими авторами [2, 3], описан сконструированный генно-инженерный штамм Escherichia coli, продуцирующий рекомбинантную пиримидиннуклеозидфосфорилазу (ПирНФаза) Thermus thermophilus. Показано, что, в отличие от широко использующихся для ферментативного синтеза модифицированных нуклеозидов тимидинфосфорилазы и уридинфосфорилазы E. coli, ПирНФаза способна использовать в качестве субстратов модифицированные нуклеозиды, содержащие атом фтора в углеводной части. Мы считаем, что использование ПирНФазы T. thermophilus в паре с пуриннуклеозидфосфорилазой (ПурНФаза) E. coli, созданной ранее в нашей лаборатории [4], позволит получать труднодоступные фторсодержащие пуриновые модифицированные нуклеозиды.

Целью данной работы явилось проверка способности ПирНФазы T. thermophilus катализировать фосфоролиз 3'-фтор-3'-дезоксиксилофуранозилурацила (3'-F-3'-dxyloU) и 3'-фтор-3'-дезокситимидина (3'-F-3'-dThd), а также синтез различных представителей класса модифицированных нуклеозидов с использованием рекомбинантных ПирНФазы T. thermophilus и ПурНФазы E. coli.

Объекты и методы исследования. В работе использовали рекомбинантные гомологичные УРФазу, ТФазу и ПурНФазу E. coli, а также рекомбинантную гетерологичную ПирНФазу T. thermophilus.

Реакцию фосфоролиза 3'-F-3'-dxyloU и 3'-F-3'-dThd изучали в присутствии ПирНФазы, ТФазы и УРФазы: к растворам, содержащим 10 мМ 3'-F-3'-dxyloU и 10 мМ 3'-F-3'-dThd в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,0 (КФБ) добавляли по 2,5 ед/мл каждого из ферментов. Реакционные смеси, содержащие ПирНФазу, инкубировали при 80 °С в течение 72 ч, а реакционные смеси, содержащие ТФазу и УРФазу, инкубировали при 40 °С в течение 72 ч.

Энзиматический синтез пуриновых 3'-фтор-3'-дезокси-β-D-рибо- и -ксилонуклеозидов осуществляли из 3'-F-3'-dxyloU и 3'-F-3'-dThd. Реакции проводили в 5 мМ КФБ и температуре 60 °С в течение 5 дней, и реакционные смеси имели следующий компонентный состав: (1) – 15 мМ 3'-F-3'-dxyloU, 10 мМ аденин (Ade), 20 ед/мл ПирНФазы, 200 ед/мл ПурНФазы; (2) – 15 мМ 3'-F-3'-dxyloU, 10 мМ 2-аминоаденин (2NH₂-Ade), 20 ед/мл ПирНФазы, 200 ед/мл ПурНФазы; (3) – 15 мМ 3'-F-3'-dThd, 10 мМ Ade, 20 ед/мл ПирНФазы, 200 ед/мл ПурНФазы; (4) – 15 мМ 3'-F-3'-dThd, 10 мМ 2NH₂-Ade, 20 ед/мл ПирНФазы, 200 ед/мл ПурНФазы.

Контроль накопления целевых продуктов проводили путем тонкослойной хроматографии на пластинах Silica gel 60F₂₅₄ (Merck, Германия) в системе растворителей изопропанол‒хлороформ‒29%-ный водный аммиак в соотношении 10:10:1 (по объему). Расположение пятен субстратов и продуктов на хроматографической пластине регистрировали в ультрафиолетовом свете, после чего вещества из пятен элюировали в 10 мМ КФБ. Концентрацию продуктов в элюатах определяли с помощью спектрофотометрии, используя известные коэффициенты молярной экстинкции. Спектры поглощения записывали на регистрирующем спектрофотометре UV-1202 фирмы «Shimadzu» (Япония).

Структуры синтезированных нуклеозидов подтверждали сравнением данных ТСХ и УФ-спектроскопии с образцами известных пуриновых 3′-фторнуклеозидов, полученных ранее химическими методами, а в отдельных случаях ‒ спектральными данными ¹H ЯМР-, УФ- и масс-спектроскопии.

Приведенные в работе экспериментальные данные представляют собой доверительные интервалы среднего арифметического для 95%-ного уровня вероятности.

Результаты и их обсуждение. На первом этапе работы установлена способность ПирНФазы T. thermophilus, ТФазы E. coli и УРФазы E. coli катализировать реакцию фосфоролиза 3'-F-3'-dxyloU и 3'-F-3'-dThd (рисунок 1).

Установлено, что степень фосфоролиза 3'-F-3'-dxyloU и 3'-F-3'-dThd в реакционных смесях, содержащих ПирНФазу, за 72 ч протекания реакции достигла 10 % и 38 % соответственно. В свою очередь показано, что ТФаза и УРФаза не способны использовать в качестве субстратов 3'-F-3'-dxyloU и 3'-F-3'-dThd. Принимая во внимание полученные результаты, а также данные ранее опубликованных работ [2, 5], где в результате проведенных экспериментов установлено, что ТФаза и УРФаза E. coli не катализируют фосфоролиз 3'-фтор-2',3'-дидезокситимидина, можно предположить, что наличие атома фтора в С3'-положении пиримидиновых нуклеозидов приводит к полной потере субстратных свойств этих соединений для ТФазы и УРФазы.

Ферментативный синтез 3-α-фторпуриновых нуклеозидов, осуществляли из пиримидиновых нуклеозидов (3′-F-3′-dxyloU и 3′-F-3′-dThd) и пуриновых гетероциклических оснований (Ade, 2NH₂-Ade) в присутствии рекомбинантных ПирНФазы T. thermophilus и ПурНФазы E. coli. В результате выполнения экспериментов получены следующие пуриновые модифицированные нуклеозиды: 3'-фтор-3'-дезокси-2-аминоксилофуранозиладенин (3′-F-3′-d-2NH₂-xyloA), 3'-фтор-3'-дезоксиаденозин (3′-F-3′-dAdo), 3'-фтор-3'-дезокси-2-аминоаденозин (3′-F-3′-d-2NH₂-Ado). Компоненты ферментативных реакций и выход целевых нуклеозидов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Синтез модифицированных нуклеозидов

№ реакционной смеси	Продукт	Донор углеводного фрагмента (15 мМ)	Акцептор (10 мМ)	Выход продукта, мол.%
1	3'-фтор-3'-дезокси-ксилофуранозиладенин (3′-F-3′-dxyloA),	3′-F-3′-dxyloU	Ade	0
2	3′-F-3′-d-2NH₂-xyloA	3′-F-3′-dxyloU	2NH₂-Ade	12±1
3	3′-F-3′-dAdo	3′-F-3′-dThd	Ade	44±3
4	3′-F-3′-d-2NH₂-Ado	3′-F-3′-dThd	2NH₂-Ade	51±3

Следует отметить, что в реакционной смеси, содержащей в качестве субстратов Ade и 3′-F-3′-dxyloU, не наблюдается образования целевого продукта.

Таким образом, в ходе выполнения экспериментов впервые с использованием ферментов синтезированы 3′-F-3′-d-2NH₂-xyloA, 3′-F-3′-dAdo, 3′-F-3′-d-2NH₂-Ado. Продемонстрированные в работе результаты ферментативного синтеза фторированных модифицированных нуклеозидов могут лечь в основу разработки препаративных технологий биотехнологического получения фармакологически перспективных пуриновых 3′-фторсодержащих нуклеозидов.

Литература:

1. Mikhailopulo I.A., Miroshnikov A.I. Biologically important nucleosides: modern trends in biotechnology and application // Mendeleev Commun. 2011. Vol. 21. P. 57–68.

2. Beresnev A.I., Kvach S.V., Sivets G.G., Zinchenko A.I. Enzymatic synthesis of 3'-fluoro-2',3'-dideoxyguanosine // Dny vedy – 2013: materialy IX Mezinarodni vedecko-prakticka konference, Praha, 27.03–05.04.2013 / red. Z. Cernak. Praha, 2013. Vol. 30. P. 51–54.

3. Szeker K., Zhou X., Schwab T. et al. Comparative investigations on thermostable pyrimidine nucleoside phosphorylases from Geobacillus thermoglucosidasius and Thermus thermophilus // J. Mol. Catal. B: Enzym. 2012. Vol. 84. P. 27–34.

4. Квач С.В., Шахбазов А.В., Зинченко А.И., Картель Н.А. Суперпродукция пуриннуклеозидфосфорилазы Escherichia coli в pET/Bl21 системе // Микробная биотехнология: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. Т. 1; под ред. Э.И. Коломиец и А.Г. Лобанка. Минск, 2007. С. 117–124.

5. Береснев А.И., Квач С.В., Сивец Г.Г., Зинченко А.И. Синтез 3'-фтор-2',3'-дидезоксигуанозина // Микробная биотехнология: фундаментальные и прикладные аспекты: сб. науч. тр. Т. 5; под ред. Э.И. Коломиец и А.Г. Лобанка. Минск, 2013. С. 19–29.