Ерошевская Л.А.¹, Лузина Е.Б.¹, Рымко А.Н.¹, Василькевич А.И.²,

Кисель М.А.², Зинченко А.И.¹

¹Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь

²Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск

Синтез фосфатидилкинетинрибозида с

использованием микробной фосфолипазы D

Кинетин представляет собой N⁶-модифицированный пурин (N⁶-фурфуриладенин), который был обнаружен как продукт деградации ДНК молок сельди, способный стимулировать деление растительных клеток [1]. Какое-то время кинетин считался неприродным (синтетическим) соединением, однако сравнительно недавно кинетин и кинетинрибозид были найдены в млечном соке кокосового ореха [2]. Кинетин влияет на рост листьев и созревание семян в процессе развития растений (что типично для цитокининов) и проявляет ряд важных биологических активностей [3]. Кинетинрибозид проявляет цитотоксическую активность в культуре клеток мышей, человека и опухолей растений [4]. Его антипролиферативные и апоптозные эффекты на опухолевых клетках человека также надежно документированы [5‒7].

Цитотоксические эффекты кинетинрибозида обусловлены его способностью вызывать быстрое истощение АТФ, приводя к генотоксическому стрессу, который активирует ген CDKN1A и другие ответственные за стресс гены [8]. Наконец, кинетинрибозид идентифицирован в качестве терапевтического агента для терапии множественной миеломы [9], острого миелобластного лейкоза [10] и рака прямой кишки [11]. Таким образом, кинетинрибозид играет важную роль при индукции клеточной гибели у клеток различных типов опухолей и может рассматриваться в качестве перспективного кандидата на статус противоопухолевого средства.

Одним из эффективных подходов к решению проблемы транспорта нуклеозидов через гидрофобные липидные биологические мембраны в клетку является химическая [12] или ферментативная (с помощью микробной фосфолипазы D [13, 14]) модификация этих соединений фосфолипидами. Цель настоящего исследования состояла в синтезе 5'-фосфатидилкинетинрибозида (ФКР; рис. 1) из кинетинрибозида и фосфатидилхолина с помощью фосфолипазы D, изолированной из фильтрата КЖ Streptomyces netropsis БИМ В-428Д.

Рис. 1 Структурная формула 5′-фосфатидилкинетинрибозида.

Процедура получения фермента и определение его активности описаны ранее [15]. Использованный в работе кинетинрибозид синтезировали методом ферментативного трансгликозилирования, как было описано нами ранее [16]. Спектры поглощения записывали на регистрирующем спектрофотометре UV-1202 фирмы «Shimadzu» (Япония).

На первом этапе работы был проведен анализ состава и структуры продуктов, образующихся в ходе изучаемого ферментативного процесса. На рис. 2 представлена хроматограмма реакционной смеси, из которой видно, что ферментативный процесс сопровождается накоплением нового продукта. Его фосфолипидная природа подтверждается окрашиванием пятна при обработке хроматограммы специфическим реагентом на фосфолипиды [17]. В спектре поглощения продукта после его выделения с помощью флэш-хроматографии наблюдается полоса поглощения при 268 нм (этанол), характерная для гетероциклического основания кинетинрибозида [18]. Соотношение содержания фосфора и хромофора в образующемся фосфолипиде составляет 1:1.

Рис. 2. Тонкослойная хроматограмма кинетинрибозида (1) и реакционной смеси до (2) и после синтеза ФКР в течение 0,5 (3), 8 (4)

и 17 (5) ч.

Проведенные эксперименты по частичной оптимизации условий реакции трансфосфатидилирования позволили предложить следующую методику синтеза ФКР. Реакционную смесь (14,4 мл), содержащую 50 мг (3,6 ммоль) кинетинрибозида, 9,65 мл хлороформа, 1,152 мл 2,5 М Na-ацетатного буфера (рН 6,0), 350 мг фосфатидилхолина (выделен из желтка куриных яиц), 0,72 мл 2 М CaCl₂ и 2,8 мл фильтрата культуральной жидкости, содержащего фосфолипазу D, перемешивали при 37^оС в течение 18 ч. Выход реакции синтеза ФКР составил >95 мол.%. Целевой продукт из конечной реакционной смеси изолировали, используя методику, описанную в работе [15]. Структура целевого продукта доказана на основании анализа данных ТСХ, УФ-спектроскопии.

Таким образом, в настоящей работе экспериментально обоснована возможность использования препарата фосфолипазы D S. netropsis для препаративного синтеза коньюгата фосфолипида с фармакологически перспективным нуклеозидом – кинетинрибозидом. Имеются основания полагать, что такая депонированная форма кинетинрибозида будет способствовать его стабильности в русле крови и повышению адресности доставки в клетки-мишени.

Литература:

1. Miller C.O., Skoog F., Von Saltza M.H., Strong F.M. Kinetin: a cell division factor from deoxyribonucleic acid // J. Am. Chem. Soc. 1955. Vol. 77. P. 1392–1393.

2. Ge L., Yong J.W.H., Goh N.K. et al. Identification of kinetin and kinetin riboside in coconut (Cocos nucifera L.) water using a combined approach of liquid chromatographytandem mass spectrometry, high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis // J. Chromatogr. B. 2005. Vol. 829. P. 26–34.

3. Barciszewski J., Massino F., Clark B.F.C. Kinetin: a multiactive molecule // Int. J. Biol. Macromol. 2007. Vol. 40. P. 182–192.

4. Griffaut B., Bos R., Maurizis J.C. et al. Cytotoxic effects of kinetin riboside on mouse, human and plant tumour cells // Int. J. Biol. Macromol. 2004. Vol. 34. P. 271–275.

5. Orr M.F., McSwain B. The effect of kinetin, kinetin ribofuranoside and gibberellic acid upon cultures of skin and mammary carcinoma and cystic disease // Cancer Res. 1960. Vol. 20. P. 1362–1364.

6. Choi B.H.; Kim W.; Wang Q.C. et al. Kinetin riboside preferentially induces apoptosis by modulating Bcl-2 family proteins and caspase-3 in cancer cells // Cancer Lett. 2008. Vol. 261. P. 37–45.

7. Cheong J., Goh D., Yong J.W.H. et al. Inhibitory effect of kinetin riboside in human heptamoa, HepG2 // Mol. Biosyst. 2009. Vol. 5. P. 91–98.

8. Cabello C.M.; Bair W.B., Ley S. et al. The experimental chemotherapeutic N 6-furfuryladenosine (kinetin-riboside) induces rapid ATP depletion, genotoxic stress, and CDKN1A (p21) upregulation in human cancer cell lines // Biochem. Pharmacol. 2009. Vol. 77. P. 1125–1138.

9. Tiedemann R.E., Mao X., Shi C.X. et al. Identification of kinetin riboside as a repressor of CCND1 and CCND2 with preclinical antimyeloma activity // J. Clin. Invest. 2008. Vol. 118. P. 1750–1764.

10. McDermott S.P., Eppert K., Notta F. et al. A small molecule screening strategy with validation on human leukemia stem cells uncovers the therapeutic efficacy of kinetin riboside // Blood. 2012. Vol. 119, N 5. P. 1200−1207.

11. Rajabi M., Gorincioi E., Santaniello E. Antiproliferative activity of kinetin riboside on HCT-15 colon cancer cell line // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids. 2012. Vol. 31, N 6. P. 474–481.

12. Alexander R.L., Kucera G.L. Lipid nucleoside conjugates for the treatment of cancer // Curr. Pharm. Des. 2005. Vol. 11, N 9. P. 1079–1089.

13. Shuto S., Ueda S., Immamura S. et al. A facile one-step synthesis of 5′-phosphatidylnucleosides by an enzymatic two-phase reaction // Tetradron Lett. 1987. Vol. 28, N 2. P. 199–202.

14. Биричевская Л.Л., Ерошевская Л.А., Кисель М.А., Зинченко А.И. Субстратные требования фосфолипазы D из Streptomyces netropsis при синтезе фосфолипидов по реакции трансфосфатидилирования // Химия природных соединений. 2006. № 1. С. 26–29.

15. Биричевская Л.Л., Хайкина Д.Б., Квач С.В. и др. Синтез 5' фосфатидилрибавирина с использованием микробной фосфолипазы D // Naukowa przestrzen Europy-2011: materialy VII miedzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji, Przemysl, 07–15 kwietnia 2011 – V. 21. – S. 54–57.

16. Береснев А.И., Ерошевская Л.А. Квач С.В., Зинченко А.И. Синтез кинетинрибозида с использованием бактериальной пуриннуклеозидфосфорилазы // Весцi НАН Беларусi. Сер. бiял. навук. 2013. № 3. С. 73–77.

17. Vaskovsky V.E. Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. An universal reagent for phospholipid analysis // J. Chromatogr. 1975. Vol. 114, N 1. P. 129–141.

18. Kissman H.M., Weiss M.J. Kinetin riboside and related nucleosides // J. Org. Chem. 1956. Vol. 21, N 9. P. 1053−1055.