Введение

Щеколова А.С., Рымко А.Н., Квач С.В., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НАНОРАЗМЕРНЫХ КОМПЛЕКСОВ СЛОИСТЫХ ДВОЙНЫХ ГИДРОКСИДОВ,

СОДЕРЖАЩИХ CPG-ДНК И ЦИКЛО-ДИГМФ

CpG-мотивы представляют собой олигодезоксинуклеотидные последовательности, содержащие в своей центральной части CpG-динуклеотид. Было показано, что ДНК бактерий, содержащая неметилированные CpG-мотивы, распознается иммунной системой позвоночных и вызывает активацию врожденного иммунитета [1]. Препараты на основе плазмидной ДНК, обогащенной CpG-мотивами (CpG-ДНК), являются перспективными для лечения бактериальных и вирусных инфекций, астмы, аллергий, некоторые виды опухолей, а также для использования в качестве адъюванта для ряда вакцин [2].

Циклический 3′,5′-дигуанилат (цикло-диГМФ) выполняет роль бактериального внутриклеточного вторичного посредника, вовлеченного в регуляцию множества сложных физиологических процессов, таких как образование биопленок, подвижность, адгезия, синтез экзополисахаридов, вирулентность и др. [3]. Недавние открытия показали, что данный циклический динуклеотид обладает стимулирующими свойствами по отношению к иммунной системе позвоночных и может быть использован в медицине в качестве терапевтического средства и адьюванта для вакцин [4].

Серьезной проблемой применения данных соединений является их низкая стабильность в русле крови. Для преодоления этой трудности предложены различные наночастицы-переносчики. Среди них наиболее перспективными считаются наноразмерные неорганические слоистые двойные гидроксиды (СДГ). Эти наночастицы характеризуются низкой токсичностью, высокой емкостью и повышенной способностью проникать в клетки, а также способностью высвобождать переносимые соединения при пониженных значениях рН, соответствующих рН внутри эндосом/лизосом [5].

Целью настоящей работы явилось получение наночастиц на основе слоистых двойных гидроксидов магния и алюминия, содержащих CpG-ДНК и цикло-диГМФ, и изучение возможности pH-зависимого высвобождения данных соединений из нанокомплексов.

Материалы и методы. Синтез комплексов СДГ–CpG-ДНК и СДГ–цикло-диГМФ осуществляли методом соосаждения. Для этого к 1,5 мл 0,1 М раствора NH₄OH, содержащего 50 мкг CpG-плазмиды или 5 мг цикло-диГМФ, добавляли 500 мкл раствора, содержащего 0,02 М MgCl₂ и 0,01 М Al(NO₃)₃. Старение полученных нанокомплексов проводили в течение 12 ч при 75^оС без доступа воздуха и при интенсивном перемешивании. Эффективность интеркаляции плазмидной ДНК и цикло-диГМФ в состав СДГ оценивали спектрофотометрически и с помощью электрофореза в 1% агарозном геле.

Для элюции соединений, комплекс осаждали центрифугированием 20 мин при 21 000 g и осадок ресуспендировали в дистиллированной воде или в 0,05 М фосфатно-цитратном буфере (рН 4,5 и 7,5). Элюцию проводили при 37^оС. Степень элюции определяли по значению оптической плотности супернатанта.

Обработку ДНКазой I проводили следующим образом: 50 мкг плазмидной ДНК или СДГ–CpG-ДНК суспендировали в 100 мкл 10 мМ Tris-HCl, содержащего 2,5 мМ MgCl₂ и 0,5 мМ CaCl₂, добавляли 1 ед. активности ДНКазы и инкубировали в течение 1 ч при 37^оС. ДНК-азу инактивировали добавлением ЭДТА до 5 мМ с последующим прогреванием при 75^оС в течение 15 мин.

Для статистической обработки результатов рассчитывали доверительный интервал среднего арифметического для 95%-го уровня вероятности. Для расчетов использовалась компьютерная программа “Microsoft Exel”.

Результаты и обсуждение. На первом этапе работы получали нанокомплексы СДГ, содержащие CpG-ДНК и цикло-диГМФ. Степень включения гостевой молекулы (лиганда) и другие характеристики полученных нанокомплексов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика нанокомплексов

Лиганд	Связывание, %	Содержание, %	Емкость
Лиганд	Связывание, %	Содержание, %	мг лиганда/мг СДГ	мг лиганда/мг комплекса	мкмоль лиганда/мг СДГ
Цикло-диГМФ	64,4±5,1	80,1±4	4,02±0,3	0,81±0,04	5,47±0,41
CpG-ДНК	95±3,1	23,8±3	0,125±0,002	0,238±0,03	0,05±0,001

Из таблицы видно, что полученные наноразмерные комплексы имеют высокую степень включения гостевой молекулы. Кроме того, емкость СДГ в отношении плазмидной ДНК ниже, чем в отношении цикло-диГМФ. Это может быть связано со стерическими особенностями взаимодействия молекул.

Следующим этапом исследования было изучение динамики элюции плазмидной ДНК и цикло-диГМФ из комплекса с СДГ при различных значениях рН. Полученные данные отражены на рисунке 1.

При постановке этого эксперимента отмечено уменьшение, а затем и полное исчезновение, осадка СДГ при инкубировании в фосфатно-цитратном буфере с рН 4,5, но не в дистиллированной воде и в том же буфере с рН 7,5, что соответствует литературным данным [6]. Полученные результаты позволяют сделать предположение о том, что элюция изучаемых соединений из комплекса с СДГ осуществляется за счет нескольких механизмов: разрушения СДГ при кислых значениях рН и протекания ионообменной реакции с замещением гостевой молекулы на неорганический фосфат, присутствующий в буфере.

Анализ CpG-ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле (рисунок 2) показал, что плазмидная ДНК иммобилизуется в СДГ и элюируется из данных наночастиц в неизмененной форме.

2

А

1

3

1

Б

2

3

Рис. 1. Динамика элюции CpG-ДНК (А) и цикло-диГМФ (Б) из комплекса с СДГ в воду (1), буфер pH 7,5 (2) и буфер pH 4,5 (3).

$G:\Публикации\2013-Днепропетровск\Элюция пДНК.jpg$

Рис. 2. Электрофореграмма CpG-ДНК до включения в СДГ (1), после включения в комплекс с СДГ (2) и после элюции из комплекса с СДГ (3).

Хроматограмма цикло-диГМФ до и после элюции из комплекса с СДГ (рисунок 3) также позволяет сделать вывод о том, что с молекулами цикло-диГМФ не происходит никаких структурных изменений.

Рис. 3. Электрофореграмма цикло-диГМФ до включения в СДГ (А) и после элюции из комплекса с СДГ (Б).

Для проверки способности СДГ защищатьCpG-ДНК от действия нуклеаз, CpG-ДНК и нанокомплекс СДГ–CpG-ДНК обрабатывали ДНКазой I. Полученные данные представлены на рисунке 4.

Из электрофореграммы видно, что свободная плазмидная ДНК деградирует полностью в описанных выше условиях, в то время как ДНК, иммобилизованная в СДГ, частично защищена от действия нуклеазы. Таким образом, иммобилизация CpG-ДНК в СДГ может в значительной степени повысить стабильность препарата на основе CpG-ДНК в русле крови.

В ходе проделанных экспериментов были впервые получены устойчивые комплексы СДГ с CpG-ДНК и цикло-диГМФ. Изучена динамика элюции плазмидной CpG-ДНК и цикло-диГМФ из комплексов с СДГ при различных значениях рН. Показано, что структура соединений после их включения в нанокомплекс и элюции из СДГ не изменяется. Кроме того, продемонстрирована способность СДГ частично защищать плазмидную ДНК от действия нуклеаз.

2000 п.о.

3000 п.о.

6000 п.о.

$C:\Users\Shchekolova\Desktop\Рис-1.jpg$

Рис. 4. Электрофореграмма CpG-ДНК: интактной (1), после обработки ДНКазой (3), в комплексе с СДГ (2), в комплексе с СДГ после обработки ДНКазой (4), извлеченной из комплекса СДГ после обработки ДНКазой.

М – маркер молекулярных масс фрагментов ДНК

Литература:

1. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects / A.M. Krieg // Annu. Rev. Immunol. 2002. Vol. 20. P. 709–760.

2. Gupta G.K., Agrawal D.K. CpG oligodeoxynucleotides as TLR9 ago-nists: therapeutic application in allergy and asthma // Biodrugs. 2010. Vol. 24. P. 225–235.

3. Zahringer F., Massa C., Schirmer T. Efficient enzymatic production of the bacterial second messenger c-di-GMP by the diguanylatecyclase YdeH from Escherichia coli // Appl. Biochem. Biotechnol. 2011. Vol. 163. P. 71–79.

4. ChenW., Lee R.K., Yan H. The potential of 3′,5′-cyclic diguanylic acid (c-di-GMP) as an effective vaccine adjuvant // Vaccine. 2010. Vol. 28, N 18. P. 3080–3085.

5. Choi S.J., Oh J.M., Choy J.H. Anticancer drug-layered hydroxide nanohybrids as potent cancer chemotherapy agents // J. Phys. Chem. Solids. 2008. Vol. 69, N 5–6. P. 1528–1532.

6. Tyner K.M., Schiffman S.R., Giannelis E.P. Nanobiohybrids as delivery vehicles for camptothecin // J. Control. Rel. 2004. Vol. 95. P. 501–514.