ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ У НАРКОЗАВИСИМЫХ ПАЦИЕНТОВ

Бычков Е.Н., Бычков А.Е.

ГБОУ ВПО «Саратовский Государственный Медицинский Университет им.

В.И. Разумовского» Минздрава РФ, Саратов, Россия

Резюме

Изучение молекулярно-генетических маркеров у наркозависимых пациентов позволит приблизиться к пониманию патологических механизмов, лежащих в основе этого заболевания и создать «генетический паспорт» для каждого пациента, страдающего данным заболевнаием. В статье представлено изучение генетических маркеров 5,10-метилентетра-гидрофолатредуктазы, участвующей в метаболизме гомоцистеина и N-ацетилтрансферазы, обеспечивающей процесс превращения ацетил-коэнзима А в ацетоацетил-коэнзим А, а также генов, участвующих в детоксикации наркотических препаратов. Обнаружены закономерности распределения полиморфных вариантов генов, кодирующих ферменты, участвующие в указанных энзиматических процессах в группе больных наркоманией, что является прологом в исследовании данного патологического процесса.

Ключевые слова: наркомания, метаболические процессы, генетические маркеры.

Введение

Фармакогенетика - наука о генетически обусловленной индивидуальной реакции организма на лекарство. Ее концептуальные положения базируются на принципах генетического разнообразия человека, связанных с наличием генетического полиморфизма. В зависимости от индивидуальных особенностей генома различные индивиды могут сохранять устойчивость или обнаруживать повышенную чувствительность к повреждающим агентам и лекарственным препаратам [1]. Большинство ксенобиотиков, попадая в организм, не оказывают прямого биологического эффекта и подвергаются биотрансформации - серии метаболических реакций, после чего выводятся из организма [2, 3, 4]. Реакции биотрансформации контролируются специальными ферментами системы детоксикации. Наследственные изменения активности таких ферментов и/или несбалансированность в их работе, обусловленные генетическим полиморфизмом, приводят к неадекватной реакции организма на различные ксенобиотики. Следствием этого могут быть нежелательные побочные реакции либо отсутствие терапевтического эффекта при приеме лекарственных средств. Наличие точных данных о химической структуре лекарства, биомеханизме его действия, а также о ферментных системах, контролирующих этот процесс, дополненных сведениями о строении соответствующих генов, способствует прогрессу фармакогенетики как одному из наиболее перспективных разделов молекулярной медицины. Более того, выявление ассоциаций полиморфных вариантов генов с различной индивидуальной чувствительностью к лекарственным препаратам позволяет не только уточнить патогенез самого заболевания, но и разработать оптимальную стратегию лечения с учетом биохимической индивидуальности пациента [4, 5, 6, 1].

Началом любой клинической симптоматики выступают изменения на молекулярном уровне, которые предшествуют развитию полноценной картины заболевания. Выявление подобных молекулярных маркеров представляет собой отдельную задачу и зависит от конечной цели исследования. Можно говорить о своеобразном «дизайне» или «скелете» проводимых исследований для получения информации о прогрессировании заболевания и ранней диагностики начальных форм патологии.

Особо следует отметить значение молекулярно-генетических исследований, поскольку многие процессы в организме детерминированы генетически и для успешного симптоматического лечения наркозависимых пациентов в обязательном порядке необходимо учитывать также и роль молекулярно-генетического фактора, поскольку биохимические показатели могут отражать метаболические процессы, протекающие в организме наркоманов и определяемые генетическим фактором [1, 9]. К такого рода процессам можно отнести детоксикацию наркотических препаратов, их проникновение в ткани головного мозга, процессы выведения наркотиков из организма и многие другие [7, 8, 9].

Материалы и методы

Исследование проводилось в течение пяти лет: с 2007 по 2011 гг. В исследование были включены 250 больных, страдавших хронической опийной наркоманией, которая привела к развитию различной выраженности печеночной и почечной патологии и артериальной гипертензии.

Всем пациентам проводилось стандартное клинико-инструментальное обследование и молекулярно-генетические исследования с использованием биочипов.

Таблица 1. Общее число обследованных наркозависимых пациентов.

Пол	Возраст
	18-29 лет		30-49 лет		50-60 лет
	абс.	%	абс.	%	абс.	%
Мужчины	102	40,8	63	25,2	39	15,6
Женщины	23	9,2	12	4,8	11	4,4
Итого (n=250)	125	50	75	30	50	20

Таблица 2. Общее число пациентов с различным стажем употребления наркотиков.

Пол	Стаж употребления наркотиков
	2-3 лет		4-5 лет		6-8 лет		более 9 лет
	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс	%
Мужчины	32	12,8	70	28	63	25,2	39	15,6
Женщины	18	7,2	5	2	12	4,8	11	4,4
Итого (n=250)	50	20	75	30	75	30	50	20

Биочипы – массивы ячеек, содержащих различные молекулярные зонды. Биочипы изготавливаются методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов акриламидного геля. Гелевые ячейки микрочипа полусферической формы химически пришиты к твердой поверхности, в каждой ячейке иммобилизированы молекулы зонда одного типа. Зонды нанесены на поверхность микрочипа в определенной последовательности, размер ячеек составляет 150 мкм. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществлялось в два этапа с добавлением праймеров, специфичных к исследуемым генам. Флуоресцентное мечение ПЦР-продукта проводили на втором этапе ПЦР с помощью красителя пентаметинового ряда. При этом праймер, содержащий флуоресцентную метку, добавляли в ПЦР-смесь в более высокой концентрации, чем немеченый праймер, таким образом, чтобы преимущественно нарабатывалась одна меченая цепь. В процессе дальнейшей гибридизации на биочипе происходило специфическое взаимодействие молекул-зондов и молекулы-мишени по принципу комплементарности. Гибридизационную смесь полностью денатурировали в течение 5 минут при 95°С, охлаждали во льду, наносили на биочип и инкубировали в течение 10-12 часов при 37°С. После завершения инкубации и удаления гибридизационной смеси поверхность биочипа высушивалась сжатым воздухом, проводилась регистрация флуоресцентных сигналов с помощью портативного анализатора, снабженного программным обеспечением Imagewer (Институт молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта РАН, Россия). Картина гибридизации представляет собой распределение сигналов флуоресценции, наиболее ярких в точках специфического связывания зонда и мишени. Метод использования ДНК-чипов высокоинформативен, позволяет анализировать до 50 полиморфных вариантов генов с точностью более 99%.

Результаты и обсуждение

Исследование полиморфизма генов MTHFR и NAT2.

Рассмотрим полиморфизмы генов, которые исследовались в данном фрагменте работы и дадим оценку превращениям наркотических препаратов, которые, скорее всего, происходят в клетках печени при участии продуктов исследованных генов. Продукт гена MTHFR осуществляет обратное превращение морфина в кодеин вследствие процесса метилирования морфина:

Концентрация кодеина и морфина в сочетании с активностью гена MTHFR определяют превращение наркотиков друг в друга и степень наркотического эффекта у различных категорий зависимых от героина пациентов. При активном цитохроме CYP2D6 и неактивном продукте гена MTHFR происходит образование больших количеств морфина и наркотический эффект будет достигаться при меньших концентрациях кодеина и морфина. В том случае, если активность цитохрома CYP2D6 снижена, а активность гена MTHFR повышена, - будет происходить обратная реакция: более интенсивно пойдет процесс превращения морфина в кодеин и наркотический эффект будет снижен.

Подобная ситуация заставит наркозависимого пациента, с одной стороны, использовать повышенные концентрации кодеина или морфина, а с другой стороны, будет способствовать применению таких препаратов как фенобарбитал, которые стимулируют образование белков-цитохромов, в частности, цитохрома CYP2D6.

Превращение героина в морфин проходит поэтапно. На первом этапе образуется 6-моноацетилморфин (6-МАМ) за счет деацетилирования одного остатка уксусной кислоты от героина и на втором этапе образуется морфин вследствие деацетилирования второго остатка уксусной кислоты от 6-МАМ. На обоих этапах участвуют два типа ферментов: ацетил-гидролазы и ацетил-трансферазы. Возможно протекание и обратного процесса с участием активной формы уксусной кислоты - ацетил-КоА - и фермента ацетил-трансферазы. Данный фермент переносит активированный остаток уксусной кислоты на морфин с образованием 6-МАМ. Подобная ситуация возможна в двух случаях: при наличии достаточных количеств ацетил-КоА и при активной форме ацетил-трансферазы, которая определяется полиморфизмом гена NAT2.

Концентрация ацетил-КоА может быть увеличена при активной работе пируватдегидрогеназного комплекса и сниженной активности цикла Кребса, одной из причин развития которой может быть гипоксия.

В нашем исследовании обнаружены следующие распределения полиморфизма генов NAT2 и MTHFR: NAT2– 70% (Т/Т полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 30%, гетерозиготы Т/С составили 68% и гомозиготы С/С были представлены 2% от всего количества исследованных образцов), NAT2^*S1– 70% (С/С полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 30%, гетерозиготы С/Т составили 68% и гомозиготы Т/Т были представлены 2% от всего количества исследованных образцов), NAT2^*S2– 65% (G/G, полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 35%, гетерозиготы G/А составили 58% и гомозиготы А/А были представлены 7% от всего количества исследованных образцов ), NAT2^*S3– 0-1% ( полиморфизм этого гена был представлен в основном «диким» типом - G/G).

Выявлен полиморфизм гена MTHFR, отвечающего за превращение морфина в кодеин и за образование гомоцистеина: MTHFR – 40% (С/С полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 60%, гетерозиготы С/Т составили 30% и гомозиготы по рецессиву - Т/Т - были представлены 10% от всего количества исследованных образцов).

Исследование полиморфизма гена MDR1.

Изучен полиморфизм гена MDR1, ответственного за синтез гликопротеида Р, который, в свою очередь, встроен в мембрану клеток гематоэнцефалического барьера и клеток энтероцитов и «отвечает» за проникновение гидрофобных и дифильных молекул через гематоэнцефалический барьер, а также через мембрану клеток кишечного эпителия.

В исследовании полиморфизм данного гена составил 80% (С/С полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 20%, гетерозиготы С/Т составили 55% и гомозиготы Т/Т были представлены 25% от всего количества исследованных образцов),

Полиморфизмы С/Т и Т/Т указывают на ослабление функции данного гена. Следовательно, только 20% наркозависимых пациентов, имеющих «дикий» тип полиморфизма могут попасть в группу риска, так как именно у них функция данного гена, скорее всего, не нарушена и гликопротеин Р, встроенный в мембрану клеток гематоэнцефалического барьера будет эффективно «выбрасывать» 6-МАМ или морфин за пределы гематоэнцефалического барьера и, следовательно, за пределы головного мозга. Это, в свою очередь, заставит зависимого пациента увеличивать дозировку наркотического препарата, что в свою очередь может привести к летальному исходу из-за развивающейся гипоксии тканей и мозга вследствие угнетения морфином клеток дыхательного центра головного мозга. Кроме того, морфин способен накапливаться в эритроцитах, провоцируя развитие транспортной гипоксии.

Наркозависимых пациентов с полиморфизмом гена MDR1 по «дикому» типу можно отнести к группе риска по развитию гипоксических состояний и, следовательно, в проводимой терапии необходимо учитывать гипоксический статус пациента и направлять лечение на коррекцию гипоксического состояния у данной группы пациентов.

Исследование полиморфизма генов цитохрома Р₄₅₀

Обнаружен полиморфизм в генах системы детоксикации у героиновых наркоманов:

СУР2С9^*2 - 20 % (С/С полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 80%, гетерозиготы С/Т составили 20% и гомозиготы Т/Т были представлены 0-1% от всего количества исследованных образцов),

СУР2С9^*3 - 20 % (А/А полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 80%, гетерозиготы А/С составили 20% и гомозиготы С/С были представлены 0-1% от всего количества исследованных образцов),

CYP2D6^*4 - 30 % (G/G полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 70%, гетерозиготы G/А составили 15% и гомозиготы А/А были представлены 15% от всего количества исследованных образцов),

CYP2D6^*3 - 0-1 % (отсутствие делеции в гене как полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 98%, гетерозиготы с делецией гена составили 0-1% и гомозиготы с делециями в гене по материнской и отцовской хромосомам были представлены 0-1% от всего количества исследованных образцов),

CYP2C19 - 25 % (G/G полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 75%, гетерозиготы G/A составили 20% и гомозиготы А/А были представлены 5% от всего количества исследованных образцов),

GSTM1 - 70 % (отсутствие делеции в гене как полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 30%, гетерозиготы с делецией гена составили 68% и гомозиготы с делециями в гене по материнской и отцовской хромосомам были представлены 2% от всего количества исследованных образцов),

CYP1A1 - 35 % (wt/wt полиморфизм, то есть «дикий» тип составил 65%, гетерозиготы 2A/wt составили 25%, гетерозиготы по полиморфизму 2В/wt составили 5% и гомозиготы 2В/2В были представлены 5% от всего количества исследованных образцов).

Заключение

У наркозависимых пациентов прослеживается взаимосвязь между печеночной и почечной паренхимой из-за утилизации наркотиков в печени с последующим их выведением через почки, поэтому состояние генов детоксикации в гепатоцитах, таких как, цитохром – CYP-2D6 является одним из индикаторов, указывающих на процессы инактивации наркотических препаратов и их эффективность.

Выявлен полиморфизм гена MTHFR, отвечающего как за превращение морфина в кодеин, так и за метаболизм гомоцистеина.

20 % наркозависимых пациентов составляют особую группу риска, так как «дикий» тип по аминокислотному составу и высокая плотность гликопротеина Р на мембранах клеток гематоэнцефалического барьера тормозит проникновение морфина и героина в клетки головного мозга наркоманов, что в свою очередь требует увеличения дозы опиатов для достижения наркотического эффекта. Полиморфизм гена MDR1 по «дикому» типу способствовать развитию гипоксии.

Список литературы

1. Голденкова-Павлова, И.В., Брускин С.А., Абдеев Р.М. и др. Сравнительный анализ результатов фенотипирования и генотипирования по полиморфизму N-ацетилирования у человека// Генетика: журнал Российской академии наук. – 2006. – Т. 42. - №8. – С. 1143-1150.

2. Vatsis, K.P. Nomenclature for N-acetyltransferases / Vatsis K.P., Weber W.W., Bell D.A. // Pharmacogenetics. – 1995 - № 5 (1). – С. 1–17.

3. Сулейманов С.Ш. особенности функционирования системы биотрансформации ксенобиотиков в адаптивных реакциях и патологии малочисленных народов Крайнего Севера: Автореф. Дисс …. докт. мед. наук. – 1997 . – 47с.

4. Hein, D.W. Molecular genetics and epidemiology of the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms/ Hein D.W., Doll M.A, Fretland A J. // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. - 2000. - №9 (1). – Р. 29 - 42.

5. Минушкина Л.О. Гены ангиотензинпревращающего фермента, NO-синтетазы и эндотелина-1 и гипертрофия миокарда левого желудочка у больных гипертонической болезнью коренных жителей Якутии// Кардиология. – 2005. – №1. – С. 41-45.

6. Oparil S, Zaman A, Calhoun DA. Pathogenesis of hypertension. Ann Intern Med 2003; 139: 761–76.

7. Miyamoto Y, Saitio Y., Kajiyama N. et al. Endothelial nitric oxide synthase gene is positively associated with essential hypertension // Hypertension. 1998. 32. 3–8.

8. Cattaneo M. Hyperhomocysteinemia, Atherosclerosis and Thrombosis. Thromb Haemost, 1999; 81: 165-176.

9. Heux S., Morin F., Lea R.A. The methylentetrahydrofolate reductase gene variant (C677T) as a risk factor for essential hypertension in Caucasians// Hypertens. Res. – 2004. – Vol. 27, №9. – P.663-667.