Бойко В.В., Красносельський М.В., Ткаченко А.С., Жуков В.І., Моісеєнко А.С., Гопкалов В.Г., Шеховцова Е.В., Моісеєнко Ю.А., Ткаченко М.О.

ДУ «Інститут загальної та невідкладної хірургії імені

Зайцева В.Т. НАМН України»,

ДУ Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор’єва

Академії медичних наук України

Харківський національний медичний університет

ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ В ПЛАЗМІ КРОВІ ХВОРИХ НА КОЛОРЕКТАЛЬНИЙ РАК З ОБТУРАЦІЙНОЮ НЕПРОХІДНІСТЮ L-АРГІНІНУ, L-ЛІЗИНУ ТА ЇХ МЕТАБОЛІТІВ ЯК ПРОГНОСТИЧНОЇ ОСНОВИ ДІАГНОСТИКИ СТУПЕНЯ ТЯЖКОСТІ

Проблема вивчення патогенезу, ранньої діагностики і покращення лікування раку товстої кишки в багатьох країнах світу, в тому числі на Україні, набуває значної актуальності. Сьогодні рак товстої кишки (колоректальний рак – КРР) є одним із поширених злоякісних новоутворень і займає в загальній структурі онкологічних захворювань четверте місце у світі. Найвищі показники захворюваності зареєстровані в розвинених країнах Європи, США, Японії – серед чоловіків – 40 випадків на 100 тисяч і серед жінок – 25-30 випадків на 100 тисяч населення. Смертність у результаті КРР у США і країнах Західної Європи займає друге місце після раку молочної залози (у жінок),третє місце після раку простати і раку легень (у чоловіків). Заслуговує уваги те, що 38% випадків колоректального раку доводиться на сигмоподібну кишку, 22% - на висхідну ободову кишку, 16% - на попереково-ободову кишку, 15% - на пряму кишку, 7% - на низхідну ободову кишку. За даними канцер – реєстру України КРР зустрічається у чоловіків частіше, а ніж у жінок [1]. На сьогодні КРР складає близько 36,5 нових випадків на рік на 100 тис. населення. Він відноситься до повільно прогресуючих пухлин і тому видається можливим прогнозування виникнення раку товстої кишки. Слід зазначити, що виживаність при КРР складає 83%, якщо рак локалізується в межах кишкової стінки, що діагностується в середньому у 11% випадках. Проте, якщо пухлина проникає через всю кишкову стінку, то виживаність хворих складає 64% [2-5]. Тому, актуальним питанням в онкології є розробка і застосування методів ранньої діагностики КРР, які базуються на подальшому вивченні молекулярних механізмів формування даної патології. Особливе занепокоєння останнім часом викликає збільшення нерезектабельних форм раку, причому ця ситуація характерна не тільки для України, але й для розвинутих країн Західної Європи і США. Згідно з літературними даними від 20% до 55% уперше зареєстрованих хворих на рак товстої кишки мають місцево інфільтративне поширення на сусідні органи і тканини, що не дозволяє видалити патологічний осередок оперативним шляхом [3-5]. З цієї причини більше третини хворих на КРР в Україні не піддаються не тільки радикальному лікуванню, але й взагалі будь-якому спеціальному лікуванню. Це призводить до високої летальності даного контингенту хворих уже в перші місяці хвороби. В наслідок пізньої діагностики захворювання, значне число хворих надходить в клініку з ускладненими формами раку товстої кишки: перифокальне запалення, розпад пухлини, кровотеча та анемія, кишкова непрохідність, проростання в сусідні органи і тканини і ін. [2, 3]. Дослідження багатьох джерел свідчать, що покращення виживання хворих потребують впровадження нових методів донозологічної діагностики передракових метаболічних станів і обґрунтування групи ризику можливого розвитку онкологічного процесу [4]. Аналіз літератури показує, що актуальним залишається питання вивчення патохімічних механізмів формування КРР шляхом дослідження як загальних показників обміну речовин і енергії, так і специфічних ланцюгів регуляції метаболічних процесів.

Метою роботи було дослідження вмісту в плазмі крові хворих на колоректальний рак, що ускладнений обтураційною непрохідністю, продуктів обміну амінокислот L-аргініну і L-лізину і обґрунтування їх прогностичного значення для визначення ступеня тяжкості перебігу хвороби.

Матеріали і методи дослідження

Для реалізації мети дослідження було сформовано дві групи хворих, що страдали на хронічну обтураційну товстокишкову непрохідність пухлинного ґенезу віком від 50 до 72 років. До першої групи (44 пацієнта) були залучені хворі з компенсованою обтураційною непрохідністю, а до другої – хворі (29 пацієнтів), що мали субкомпенсовану обтураційну непрохідність та відповідно III і IV стадією патологічного процесу. Серед осіб у яких клінічними, лабораторно-інструментальними і гістологічними методами було встановлено діагноз КРР і стадію захворювання, перебувало 38 чоловіків і 35 жінок. Всі хворі з діагностованим КРР перебували на лікуванні і обстеженні в Харківському обласному онкологічному центрі. До групи порівняння було включено, 18 умовно здорових осіб аналогічного віку і статі. Програма дослідження передбачала визначення в плазмі крові вмісту L-аргініну, орнітину, лізину, поліамінів – путресцину, спермідину, сперміну і активності ферменту орнітиндекарбоксилази. Амінокислоти аргінін, орнітин і лізин, визначали методом іонообмінної хроматографії на іонітах з використанням автоматичного аналізатор амінокислот ААА-339. Вміст їх в плазмі крові порівнювали із стандартами калібровочних концентрацій і виражали в нмоль/мл [6]. Концентрацію поліамінів визначали в плазмі крові шляхом їх екстрагування із дослідного матеріалу, випарювання екстракту, розчинення його з наступним електрофоретичним розділом, фарбування розчином нінгідрину і кількісним визначенням шляхом денситометрії. При цьому, електрофоретичний розділ поліамінів проводили в 1,5% агаровому гелі та в 0,1М цитратному буфері з РН=3,4 при напрузі 200В і силі току 40мА на протязі 1 год.30 хв. [7-9]. Орнітиндекарбоксилазна активність визначалась шляхом інкубації дослідного матеріалу з орнітином, наступним проведенням реакції динітрофенілірування і колориметрією кінцевого продукту [10]. Отримані результати оброблялися методом варіаційної статистики з використанням критерія Стьюдента-Фішера.

Результати дослідження та їх обговорення

Результати дослідження плазмових амінокислот (L-аргініну, орнітину, L-лізину) виявили суттєве підвищення L-аргініну, зниження орнітину і L-лізину як при компенсованій, так і субкомпенсованій обтураційній непрохідності в умовах розвитку колоректального раку (табл. 1). Відомо, що L-аргінін є попередником утворення орнітину при синтезі сечовини. Поряд з тим, дана незамінна амінокислота може бути джерелом і для утворення оксиду азоту (NO) під впливом окислювальної реакції, що каталізується ферментом NO–синтазою (NOS), яка є поліфункціональную оксидоредуктазою. Внаслідок цієї каталітичної реакції утворюється оксид азоту. Дослідження динамічних змін вмісту L-аргініну дають підставу судити про зниження метаболізму сечовини, як наслідок пригнічення активності фермента аргінази [11]. Поряд з тим, підвищення в плазмі крові L-аргініну може свідчити про пришвидшений розпад білків та зниження метаболічних процесів, що пов'язані з відновлювальними синтезами в яких використовується дана амінокислота [6].

Таблиця 1

Вміст деяких протеїногенних і непротеїногенних амінокислот в плазмі крові хворих на колоректальний рак, ускладнений обтураційною непрохідністю

Показники	Група спостереження М±m
	Умовно здорова (n=18)	Компенсована непрохідність (n=44)	Субкомпен-сована непрохідність (n=29)
L-аргінін, (нмоль/мл)	24,56±1,73	37,43±1,88*	42,68±2,85*
Орнітин (нмоль/мл)	13,68±1,27	7,24±0,63*	5,32±0,46*
L-лізин (нмоль/мл)	34,53±2,84	21,44±1,53	14,23±1,26*

Примітка:* різниця вірогідна р<0,05

Аналіз вмісту орнітину в плазмі крові виявив зниження його вмісту на 47,08% і 61,12, відповідно при компенсованій і субкомпенсованій обтураційній непрохідності. Із відомих наукових джерел можна судити, що за умови розвитку КРР порушена функція синтезу сечовини із L-аргініну в печінці хворих на КРР, а зниження в плазмі орнітину може свідчити про його прискорене використання для синтезу поліамінів і інших субстратів обміну речовин [6]. Оцінка вмісту L-лізину виявила зниження його концентрації в плазмі крові хворих на КРР з компенсованою і субкомпенсованою непрохідністю відповідно на 37,91 і 58,79%. Ці дані переконливо доводять, що як орнітин так і L-лізин можуть в умовах підвищеної декарбоксилазної реакції бути джерелом синтезу поліамінів, які залучаються до багаточисельних фізіологічних процесів: регуляція експресії генів, трансляція, проліферація клітин, модуляція сигналізації клітин, стабілізація мембран, неспецифічна антиоксидантна дія, виконання функції модулятора мембранних рецепторних іонофорних комплексів, специфічна взаємодія поліамінів з нуклеїновими кислотами (ДНК, РНК), білками, участь в організації хроматину, генезисі рибосом, міжклітинній взаємодії, активації багатьох ферментів і ін. [7-11].

Визначення вмісту в плазмі крові хворих на КРР поліамінів виявило підвищення рівнів путресцину, спермідину і зниження сперміну (табл. 2). Путресцин зростав на 105,27% і 150,98%, спермідин - на 91,77% і 159,78% на фоні зниження вмісту сперміну на 33,70% і 8,56%, відповідно при компенсованій і субкомпенсованій обтураційній непрохідності. Дослідження орнітиндекарбоксилазної активності показало підвищення активності ферменту на 50% і 214,51%, відповідно при компенсованій і субкомпенсованій обтураційній непрохідності. Динамічні зміни поліамінів можуть вказувати, що зростання концентрації путресцину і спермідину тісно зв’язано з підвищенням активності орнітиндекарбоксилази, тоді як зниження спермідину - з процесами утилізації даного субстрату для метаболічних цілей і відновлювальних синтезів [6]. Результати оціночних показників вказують на тісний зв'язок між обміном L-аргініну, орнітину, L-лізину і вмістом в плазмі крові поліамінів – путресцину, спермідину, сперміну та активністю орнітиндекарбоксилази, які корелюють з тяжкістю перебігу хвороби. Аналіз обміну амінокислот L-аргініну і L-лізину свідчить, що вони активно залучені в молекулярні механізми реалізації реакції організму на формування пухлинного росту при КРР, які супроводжуються підвищенням активності орнітиндекарбоксилази і вмісту поліамінів - путресцину і спермідину. Відомо, що ці поліаміни запускають активацію генів «ранньої» відповіді: c-fos, c-jus і c-myc, яка супроводжується підвищенням активності орнітиндекарбоксилази і вмісту путресцину. При цьому спостерігається і більш висока активація ферментів розпаду поліамінів, яка перевищує їх синтез, що супроводжувалося зниженням вмісту в плазмі крові сперміну (табл. 2). Результати показують, що при КРР спостерігається підвищення активності як ферментів синтезу, так і розпаду поліамінів, а це на думку багатьох авторів може привести до порушення процесів клітинного метилування ДНК, гістонів і інших клітинних функцій, що пов'язані з метилуванням [11, 12].

Таблиця 2

Вміст поліамінів в плазмі крові хворих на колоректальний рак і активність ферменту орнітиндекарбоксилази при ускладненій обтураційній непрохідності

Показники	Група спостереження М±m
	Умовно здорові (n=18)	Компенсована непрохідність (n=44)	Субкомпен-сована непрохідність (n=29)
Орнітиндекарбоксилаза (нмоль путресцину/мг білка год.)	0,62±0,05	0,93±0,08*	1,95±0,16*
Путресцин (нмоль/мг білка)	1,53±0,16	3,14±0,29*	3,84±0,26*
Спермідин (нмоль/мг білка)	6,44±0,57	12,35±0,98*	16,73±1,37*
Спермін (нмоль/мг білка)	2,76±0,24	1,83±0,12*	1,42±0,13*

Примітка:* різниця вірогідна р<0,05

Таким чином, результати дослідження свідчать, що колоректальний рак супроводжується порушенням обміну амінокислот L-аргініну, орнітину і L-лізину. Ці зміни характеризувалися підвищенням вмісту в плазмі крові L-аргініну і зниженням орнітину і L-лізину, що може вказувати на пригнічення синтезу сечовини із аргініну та прискорення механізмів використання орнітину і L-лізину для відновлювальних синтезів, які поєднані з накопиченням поліамінів – путресцину, спермідину і зниженням вмісту крові сперміну, що віддзеркалює активацію метаболічних процесів пов'язаних з утилізацією даного субстрату. Аналіз обміну амінокислот L-аргініну і L-лізину свідчить про те, що вони активно залучені до молекулярних механізмів реалізації реакції організму у формуванні пухлинного росту при КРР, які супроводжуються підвищенням активності як ферментів синтезу, так і розпаду поліамінів, і є важливим ланцюгом патогенезу злоякісних пухлин товстої кишки.

Дисбаланс вмісту L-аргініну, орнітину, L-лізину, поліамінів – путресцину, спермідину, сперміну у плазмі крові хворих на КРР з обтураційною непрохідністю вказує на багаточисельні порушення всіх видів обміну речовин і енергії, які в умовах лікування потребують патогенетичної корекції і нутрітивної підтримки.

Література

1. Рак в Украине 2009-2013. Заболеваемость смертность показатели деятельности онкологической службы. – Бюл. Национального канцер – реестра Украины. – К.: 2014. – 108 с.

2. Ханевич М.Д. Колоректальный рак. Выбор хирургического лечения при толстокишечной непроходимости / М.Д. Ханевич, Г.М. Манихас, В.В. Лузин [и др.] // – Спб:, Аграф, 2008. – 136 с.

3. Кожнюк В.Т. Колоректальный рак / В.Т. Кожнюк // Минск: Харвест, 2005. – 384с.

4. Шелехов, А. В. Эндохирургические технологии в комбинированном лечении осложненных форм колоректального рака: дис. … д-ра мед. наук: 14.0014 / А.В. Шелехов. – Томск: Иркут. гос. ин-т усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохр. и соц. развитию, 2009. – 251 с.

5. Ерюхин И.А. Кишечная непроходимость: руководство для врачей / И.А. Ерюхин, В.П. Петров, М.Д. Ханевич // СПб.: Питер, 1999. – 448с.

6. Зорькин А.А. Метаболические процессы при некоторых экстремальных состояниях / А.А. Зорькин, Б.М. Курцер, А.П. Довжанский // «Штиинца», – Кишинев,1985. – 246с.

7. Николаев А.А., Плосконос М.В., Слуцкий Д.Л., Ефимов Т.В. Способ определения полиаминов в биологической жидкости / Патент РФ № 2225981 от 20.03.2004г.

8. Чудинов А.А. Метод определения низкомолекулярных олигоаминов в различном биологическом материале / А.А. Чудинов, Л.А. Чудинова, В.П. Коробов // Вопросы медицинской химии. – 1984. – №4. – С. 127-128.

9. Сяткин С.П. Микрометод флюорометрического определения содержания полиаминов и путресцина в тканях животных тонкослойной хроматографией на пластинках Силуфол UV-254 / С.П. Сяткин, Т.Т. Березов // Вопросы медицинской химии. – 1981. – №6. – С. 848-849.

10. Храмов В.А. Простой метод определения активности орнитиндекарбоксилазы в смешанной слюне человека / В.А. Храмов // Клиническая и лабораторная диагностика. – 1997, №4. – С.14-15.

11. Зайцева О.В. Состояние активности NO-синтазы и содержание оксида азота у больных псориазом / О.В. Зайцева, Н.В. Жукова, Е.А. Броше // Вісник проблем біології і медицини. – 2002. –№3. –С. 80-85.