Біологічні науки/5.

Студент Панасюк І.В.

Національний університет харчових технологій, Київ, Україна

ПОТЕНЦІОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР НА ОСНОВІ РЕКОМБІНАНТНОЇ УРЕАЗИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІЇ СЕЧОВИНИ У СИРОВАТЦІ КРОВІ ХВОРИХ НА НИРКОВУ НЕДОСТАТНІСТЬ

Сечовина – головний і кінцевий продукт обміну білків, синтез якої відбувається в печінці з диоксиду вуглецю та амонію в результаті дезамінування амінокислот. З печінки сечовина потрапляє в кров, а далі в нирки, де і відбувається її фільтрація та виведення з сечею. Зниження вмісту сечовини в плазмі крові спостерігається рідко і є характерним для пацієнтів з тяжким захворюванням печінки чи недостатнім вживанням білку. Дуже високий рівень сечовини в сироватці крові пов’язаний з тяжкою нирковою дисфункцією і називається синдромом уремії. В такому випадку необхідно проводити гемодіаліз чи трансплантацію нирки. Здебільшого надають перевагу першому варіанту.

Фізіологічний рівень сечовини знаходиться в межах 2,5 – 7,5 мМ [1] залежно від харчування. Значне підвищення концентрації сечовини спостерігається під час хронічної та гострої форм ниркової недостатності (50 – 70 та 120 -150 мМ відповідно). Такий патологічний рівень сечовини можна знизити до 10 мМ за рахунок гемодіалізу чи перитоніального діалізу. Рівень сечовини у діалізаті може варіювати від 3 до 16 мМ [2].

Для встановлення ранньої стадії ниркової недостатності необхідно визначити кліренс сечовини. Кліренсом називається співвідношення між загальною кількістю речовини, яка виводиться із сечею за добу і концентрацією речовини у крові. Нормальний кліренс сечовини становить 64 – 99 мл/хв і залежить від віку та статі. Таким чином, для діагностування різних порушень у хворих необхідно виконувати складні та багатократні аналізи на сечовину [3].

Для моніторингу рівня сечовини існує три групи методів. До методів першої групи умовно можна віднести хімічні методи з колориметричною детекцією. До колориметричних реагентів відносяться диацетилмонооксим, фталальдегід, нафтилетилендіамін, хромотропова кислота [4]. Одним із найбільш популярним реактивом в сучасній клінічній діагностиці сечовини являється диацетилмонооксим [5]. Але основний недолік цього методу – світлочутливість комплексу і швидке зниження його забарвлення, що частково компенсується введенням в реакцію стабілізатора тіосемикарбазиду. Іншим недоліком методу являється токсичність реактивів для проведення даної реакції.

Другу групу представляють ферментативні методи. Всі сучасні ферментативні методи визначення сечовини ґрунтуються на використанні ферменту уреази. Метод складається з двох етапів. На першому при гідролізі сечовини утворюється іон амонію, концентрацію якого (другий етап) визначають з використанням послідовних ферментативних реакцій, потенціометричних методів чи технології “сухої хімії”.

Найбільш популярний ферментативний метод визначення сечовини в сироватці крові чи сечі ґрунтується на використанні уреази для розщеплення сечовини, та глутаматдегідрогенази в якості індикаторного ферменту, для визначення амонію. Реакція проходить за участю кофермента НАДН_2, кетоглутарату та АТФ з утворенням глютамінової кислоти і АДФ. Ця реакція спряжена з окисленням НАДН₂ до НАД, що супроводжується зміною оптичної щільності розчину, яке в даному випадку контролюють при довжині хвилі 340 нм [5].

Слід зауважити, що вище наведені методи складні у використанні в зв’язку з цілим комплексом реакцій, на яких грунтується аналіз, потребують попередньої пробопідготовки, необхідний контроль температури, рН і непридатні для on-line вимірювань.

До третьої умовної групи методів контролю рівня сечовини відносять біосенсори. На сьогоднішній день створено цілу низку уреазних біосенсорів, де в якості чутливого елементу виступає фермент уреаза: амперометричних, потенціометричних, кондуктометричних та оптичних. Головним недоліком таких біосенсорів є вузький лінійний діапазон визначення, тому перед вимірюванням необхідно в значній мірі розводити біозразки, що призводить до зниження точності аналізу. Одним із підходів для вирішення даної проблеми є використання рекомбінантного ферменту уреази з модифікованим активним центром . Рекомбінантна уреаза з E. coli має заміну в активному центрі: гістидин 219 замінено на інший амінокислотний залишок, за рахунок чого змінюється спорідненість до субстрату. В результаті Km рекомбінантного ферменту зростає до 200 мМ, порівняно з уреазою з традиційного джерела виділення (боби сої) , Km якої становить 3 – 8 мМ.

Отже, за допомогою розробленого біосенсора на основі рН-чутливих польових транзисторів та рекомбінантної уреази проведено кількісний аналіз концентрацій сечовини в сироватці крові хворих на ниркову недостатність.

Література:

1. Dhawan G., Sumana G., Malhotra B.D., Recent development in urea biosensors // Biochemical Engineering Journal. – 2009.- Vol. 44. – P. 42 – 52.

2. Koncki R., Recent development in potentiometric biosensors for biomedical analysis // Analytica Chimica Acta. – 2007. – Vol. 599. – P. 7 – 15.

3. Gutiérrez M., Alegret S., del Valle M., Bioelectronic tongue for the simultaneous determination of urea, creatinine and alkaline ions in clinical samples // Biosensor and Bioelectronics. – 2008. – Vol. 23. – P. 795 – 802.

4. Jurkiewicz M., Alegret S., Almirall J., García M., Fàbregas E., Development of a biparametric bioanalyser for creatinine and urea. Validation of the determination of biochemical parameters associated with hemodialysis // Analyst. – 1998. – Vol. 123. – P. 1321 – 1327.

5. Fearon W.R., The carbamide diacetyl reaction: a test for citrulline // Biochem. J. – 1939. – Vol. 33. – P. 902 – 907.