Біологічні науки/ 6.Микробиология.

 

Студент Панасюк К.В., Конон А. Д., Пирог Т.П.

Національний університет харчових технологій, Україна

ОСОБЛИВОСТІ СИНТЕЗУ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН NOCARDIA VACCINII IMB B-7405 ЗА ПРИСУТНОСТІ КАТІОНІВ МІДІ

 

Потужне техногенне навантаження на навколишнє середовище упродовж останніх років робить проблему очищення біосфери від ксенобіотиків досить нагальною. Найбільшими забрудниками довкілля є нафти і продукти її переробки, а також важкі метали [1]. Враховуючи, що в забруднених екосистемах спостерігається одночасна наявність як нафти, так і важких металів, актуальним є розробка методів знешкодження таких комплексних забруднень [2]. Одними із таких методів є біологічні, основані на використанні мікроорганізмів і продуктів їхньої життєдіяльності, зокрема поверхнево-активних речовин (ПАР) [2, 3].

У попередніх дослідженнях із забрудненого нафтою ґрунту виділено штам нафтоокиснювальних бактерій, ідентифікований як Nocardia vaccinii  К-8, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології за номером IMB B-7405, встановлено здатність даного штаму до синтезу  ПАР на гідрофобних (гексадекан, рідкі парафіни) та гідрофільних (глюкоза, етанол, гліцерин) субстратах.

Мета даної роботи – дослідження впливу важких металів на синтез ПАР           N. vaccinii  IMB B-7405, а також можливості застосування поверхнево-активних речовин для очищення води від нафти за присутності катіонів міді.

Культивування бактерій проводили на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 – 1,0; KH2PO4 – 0,1; MgSO4x7H2O – 0,1; CaCl2´2H2O – 0,1, рН 6,8–7,0. 

Як джерело вуглецю та енергії використовували гліцерин – 1,5% (об’ємна частка), рідкі парафіни 2,0 % (об’ємна частка) та гексадекан 2,0 % (об’ємна частка).

У середовище додатково вносили дріжджовий автолізат – 0,5 % (об’ємна частка) і FeSO4´7H2O – 0,01 г/л.

На початку процесу культивування, в експоненційній та стаціонарній фазі росту штаму IMB B-7405 в середовище культивування вносили Сu2+ (0,1–0,5 мМ)  у вигляді 0,1 М розчину солі СuSO4×5H2O.

Як посівний матеріал використовували культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину, гексадекану та рідких парафінів за присутності Сu2+ або без. Кількість посівного матеріалу становила 10 % від об’єму середовища.

Як препарати ПАР для очищення від комплексних забруднень (нафта і катіони міді) використовували постферментаційну культуральну рідину і супернатант  N. vaccinii IMB B-7405. Для отримання супернатанту культуральну рідину центрифугували (5000 g) протягом 30 хв.

Моделювання забруднених нафтою і металами водойм здійснювали наступним чином: в пластикову ємність вносили 2 л бюветної води, на поверхню якої наносили 6 мл нафти,  після чого добавляли препарати ПАР в концентрації 5 % (об'ємна частка), а також  0,1–0,5 мМ Сu2+. Як джерело біогенних елементів використовуволи диамонійфосфат  (0,01 %). Загальну кількість живих клітин в бюветній воді упродовж експеременту (21 доба) визначали методом Коха на м̓ясопептоному агарі.

Параметри росту і синтезу ПАР оцінювали за наступними показниками: концентрація біомаси, поверхневий нятяг та індекс емульгування.

На першому етапі досліджували вплив Сu2+ на ріст і синтез ПАР N. vaccinii  IMB B-7405 на гліцерині. Встановлено, що у разі внесення 0,1 мМ Сu2+ в експоненційній і стаціонарній фазі росту N. vaccinii  IMB B-7405 показник умовної концентрації ПАР (ПАР*) збільшувався у 2,0 і 1,5 рази відповідно порівняно з вирощуванням на середовищі без металу. При культивуванні штаму IMB B-7405  на рідких парафінах і н-гексадекані за наявності 0,1–0,5 мМ Сu2+ спостерігали  незначне інгібування синтезу ПАР, про що свідчило зниження показника ПАР*.

У попередніх дослідженнях встановлено, що за внесення катіонів міді у середовище культивування Rhodococcus erythropolis ІМВ Ас-5017 та Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 на гідрофобних субстратах, спостерігали інтенсифікацію синтезу ПАР у кілька разів, що зумовлено активуючим впливом Сu2+ на активність алкангідроксилази (першого ферменту катаболізму н-алканів) [4]. На нашу думку відсутність стимуляції синтезу ПАР N. vaccinii  IMB B-7405 катіонами міді на вуглеводневих субстратах може бути зумовлене функціонуванням у даного штаму іншої алкангідроксилази, яка не активується.

Зазначимо, що незважаючи на достатньо високу  концентрацію  Cu2+ (0,5 мМ) у середовищі спостерігали лише часткове пригнічення росту ПАР (в жодному з варіантів не відзначалося повного інгібування росту і утворення ПАР). На нашу думку, це явище могло бути зумовлене захисними функціями синтезованих ПАР, тому на наступному етапі вивчали роль ПАР N. vaccinii ІМВ В-7405 у захисті клітин продуцента від токсичного впливу катіонів міді. Встановлено, що за присутності ПАР виживання клітин  N. vaccinii  IMB B-7405 було на 10–45 % вищим, ніж без них.

На наступному етапі досліджували вплив препаратів ПАР N. vaccinii  IMB B-7405 у вигляді постферментаційної культуральної рідини на деструкцію нафти (2,6 г/л)  у воді за присутності катіонів міді (0,1–0,5 мМ) (табл.). Встановлено, що на 21 добу після обробки препаратами ПАР ступінь очищення води  за присутності Сu2+ становив 89–98 %, у тоді як без металу – всього 23 %, що може бути зумовлено стимуляцією Cu2+ алкангідроксилази нативної мікрофлори, а також захисними функціями ПАР.  

 

 

 

Таблиця                                                                                                  

Деструкція нафти у воді за присутності ПАР N. vaccinii IMB B-7405   і Сu2+

Препарат ПАР

Концентрація  Сu2+  у забрудненій нафтою  воді, Мм

Вирощування N. vacсinii  IMB B-7405  за присутності Сu2+,  мМ

Ступінь деструкції нафти, %

Культуральна  рідина

0,1

0,1

94±4,7

0,5

0,1

39±2,0

0,1

–

98±4,9

0,5

–

89±4,5

0

–

23±1,2

Супернатант

0,1

0,1

90±4,5

0,5

0,1

27±1,4

0,1

–

94±4,7

0,5

–

85±4,3

Контроль (без ПАР та  Сu2+)

15±0,8

Примітка:  « – »   –   Сu2+ під час вирощування штамму ІМВ В-7405 у середовище не вносили

Під час внесення у модельні водойми супернатанту культуральної рідини характер процесу був таким самим, як описано для культуральної рідини, але швидкість його була нижчою.

Ми, припускаємо, що інтенсифікація деструкції комплексних нафтових забруднень за присутності ПАР і Сu2+ зумовлена стимуляцією нативної  мікрофлори в результаті солюбілізації нафти, активації катіонами міді алкангідроксилаз як штаму-продуцента ПАР, так і природної нафтоокиснювальної мікрофлори, а також захисними функціями ПАР.

Отже, одержані дані показують можливість підвищення синтезу ПАР               N. vaccinii  IMB B-7405 на гліцерині внесенням Cu2+ у середовище, а також застосування препаратів ПАР для деструкції комплексних з важкими металами нафтових забруднень.

 

Література

1. Tyagi M. Fonseca M.R., Carvalho C.R.  Bioaugmentation and biostimulation strategies to improve the effectiveness of bioremediation processes // Biodegradation. – 2011. – V. 22, № 2. – P. 231–241.

2. Gadd G.M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation  // Microbiol. – 2010. –  V. 156, № 3. – P. 609–643.

3. Mulligan C.N., Yong R.N., Gibbs B.F. Heavy metal removal from sediments by biosurfactants // J. Hazard. Mater. – 2001. − Vol. 85, № 1–2. – P. 111−120.

4. Пирог Т.П., Конон А. Д. , Софилканич А.П., Шевчук  Т.А. , Парфенюк С.А.. Влияниє  Cu2+ на синтез поверхностно-активных веществ  Acinetobacter calcoaceticus  ИМВ В-7241 и Rhodococcus erythropolis ИМВ Ас-5017// Мікробіологічний журнал. ─ 2013. ─ Т. 75, №1. – С. 3–13.