Герешко А. М.

Національний університет харчових технологій, Україна

Оптимізація робочих характеристик потенціометричного біосенсора на основі рекомбінантної уреази з E. сoli

Термінальна стадія хронічної хвороби нирок V стадії є значною медико-соціальною проблемою в усьому світі. Особливої актуальності ця проблема набуває з погляду на стабільне (до 7 % щорічно) збільшення кількості хворих, що потребують лікування методами замісної ниркової терапії, а саме гемодіалізом. Саме сечовина є тією біомолекулою, моніторинг якої надає інформацію про стан нирок [1]. Визначення концентрації сечовини в сироватці крові є одним з найпоширеніших тестів в клінічній лабораторній діагностиці [2]. Сечовина — кінцевий та головний продукт обміну білків, її рівень дає інформацію про стан системи травлення в цілому; є маркером широкого спектру низько- та середньомолекулярних токсичних речовин; являється діагностичним показником функції печінки [3,4].

На сьогоднішній день досить перспективним для визначення сечовини є біосенсорний метод на основі рН-чутливих польових транзисторів та іммобілізованої уреази, за рахунок високої чутливості і селективності, оперативності отримання результатів, можливості роботи в польових умовах, відносною простотою [5], придатністю для оn-lіnе вимірювань.

Але, не зважаючи на значний розвиток біосенсорів для моніторингу сечовини, дуже рідко підкреслюють недоліки пов’язані з їх практичним застосуванням. Головним недоліком таких біосенсорів є вузький лінійний діапазон визначення, тому перед вимірюванням необхідно в значній мірі розводити біозразки, що призводить до зниження точності аналізу. Одним із підходів для вирішення даної проблеми є використання рекомбінантного ферменту уреази.

Тому головною метою даної роботи є оптимізація робочих характеристик та дослідження стабільності при зберіганні біосенсора на основі рекомбінантної уреази з E. coli.

Відомо, що однокомпонентний буфер змінює буферну ємність при зміні його рН. Щоб уникнути додаткових впливів буферних ємностей на величини відгуків, було досліджено залежність відгуків біосенсора від рН універсального багатокомпонентного буфера. Як результат, ми отримали оптимум рН роботи іммобілізованого ферменту, що знаходився в межах 6,0 – 6,5. Тому, не виключено, що в майбутньому необхідно перейти на інший метод іммобілізації.

Наступне завдання полягало у дослідженні параметру робочого буферу, а саме буферної ємності на відгук біосенсора на основі Р. уреази. В результаті дослідження ми побачили, що зміна концентрації буферного розчину в значній мірі впливає на величину відгуків біосенсора та призводить до розширення лінійного динамічного діапазону визначення сечовини. Так, зміна концентрації буферу від 5 до 40 мМ призводить до зміни лінійного діапазону з 5 – 15 мМ до 5 – 40 мМ відповідно. При цьому, чутливість біоселективної мембрани щодо наявності субстрату виявилася найбільшою у 5 мМ фосфатному буфері, а найменшою – у 40 мМ.

Ще одним не менш важливим параметром буферного розчину є іонна сила. З отриманих результатів було видно, що при збільшенні концентрації NaCl до 150 мМ, а відповідно і йонної сили, до 150 мМ спостерігається падіння сигналу на 40 %.

Операційна стабільність роботи біосенсорів є ще однією важливою характеристикою. Біосенсор при квазібезперервній роботі протягом дня характеризувався високою відтворюваністю сигналу, стандартне відхилення становило всього 2,2 %.

З метою можливих подальших досліджень розробленого біосенсора було проведено ряд дослідів по вивченню його стабільності при зберіганні в різних умовах. Активність біосенсора, що зберігався в сухих умовах при температурі +4°С знизилась приблизно на 30 % протягом 4-5 тижнів. Схожа ситуація була і при зберіганні біосенсора в 5 мМ фосфатному буфері рН 7,4, але тільки на 1-2 %. І лише зберігання в буфері з азидом натрію, ЕДТА та дитіотриетолом призводило до збереження стабільної роботи сенсора та навіть збільшення відгуків майже вдвічі протягом більше місяця.

Таким чином, було підібрано оптимальні умови роботи іммобілізованого рекомбінантного ферменту: залежність від рН, іонної сили, концентрації робочого буферного розчину. Біосенсор характеризувався високою операційною стабільністю та відтворюваністю сигналів, стабільністю при зберіганні.

Література:

1. Melo de J.V., Soldatkin A.P., Martelet C., Jaffrezic-Renault N., Cosnier S., Use of competitive inhibition for driving sensitivity and dynamic range of urea ENFETs // Biosensors and Bioelectronics.– 2003. - № 18. – P. 345 – 351.

2. Kuralay F., Ozyoryk H., Yildiz A., Amperometric enzyme electrode for urea determination using immobilized urease in poly(vinylferrocenium) film // Sensor and Actuators B. – 2006. – Vol.114.– P. 500 – 506.

3. Boubriak O.A., Soldatkin A.P., Starodub N.F., Sandrovsky A.K., El’skaya A.V., Determination of urea in blood serum by a urease biosensor based on an ion-sensitive field-effect transistor // Sensor and Actuators B. – 1995. – Vol.26 – 27. – P. 429 – 431.

4. Gutierrez M., Alegret S., del Valle M., Bioelectronic tongue for the simultaneous determination of urea, creatinine and alkaline ions in clinical samples // Biosensor and Bioelectronics. – 2008. – Vol.23.– P. 795 – 802.

5. Chen J.C., Chou J.C., Sun T.P., Hsiung S.K., Portable urea biosensor based on the extendedgate field effect transistor // Sensor and Actuators B. – 2003. – Vol. 91. – P. 180 – 186.