К.м.н. Москвичев Е.В., д.м.н. Стручко Г.Ю., д.м.н. Меркулова Л.М., к.м.н. Михайлова М.Н., Кострова О.Ю.

ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова»,

кафедра нормальной и топографической анатомии, г. Чебоксары, Россия

Возрастная инволюция и острая атрофия тимуса при экспериментальном канцерогенезе

Известно, что рост злокачественных новообразований, зачастую, сопровождается продукцией ими веществ, угнетающих защитные силы организма. Это в свою очередь приводит либо к снижению противоопухолевого иммунного ответа, либо к полному его блокированию [12]. При этом опухоль перестает распознаваться иммунными клетками как чужеродная или дефектная ткань, и становится биологически более агрессивной. Было установлено, что одну из ключевых ролей в этом процессе играют T-reg клетки, а так же дендритные клетки, присутствующие в большом количестве в зоне локального иммунного ответа на границе роста опухоли [2]. Иммуносупрессивные T-reg клетки имеют фенотип CD3+/CD4+/CD25+/Foxp3 и могут происходить из зрелых периферических T-лимфоцитов с фенотипом CD3+/CD 4+/CD25- [11]. Есть мнение, что увеличение в опухоли числа T-reg клеток сочетается с плохим прогнозом и низкой эффективностью лечения [13].

Кроме подавления локального иммунного ответа, опухоль обладает прямым угнетающим влиянием на иммунные органы, что приводит к снижению ими продукции иммунокомпетентных клеток либо к выработке дефектных цитотоксических лимфоцитов, которые так же могут служить источником происхождения иммуносупрессивных T-reg клеток [6; 10]. Однако механизм прямого супрессорного влияния опухоли на иммунные органы до конца не ясен.

Немаловажное значение в развитии злокачественных новообразований принадлежит иммунодефицитам. Известно, что старение сопровождается угнетением многих звеньев иммунитета, при этом страдают как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ [7]. В настоящее время снижение иммунной реактивности организма вследствие старения считается одной из причин более высокой заболеваемости раком у пожилых по сравнению с молодыми [3]. Есть мнение, что это может быть обусловлено возрастной инволюцией вилочковой железы [5].

Цель исследования - установление морфологических характеристик, отражающих влияние развивающейся злокачественной опухоли толстой кишки на центральный орган иммуногенеза – тимус и сравнение их с изменениями при возрастной инволюции железы.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 32 белых нелинейных крысах-самцах 5 месяцев массой 180-220 грамм. Уход и содержание животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Животные были разделены на две группы. Первой группе (22 крысы) внутрибрюшинно водили 1,2-диметилгидразин из расчета 20 мг/кг массы 1 раз в неделю в течение 5 недель в соответствие с экспериментальной моделью [4]. Контролем служили 10 интактных крыс соответствующего возраста, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия. Выведение опытных животных из эксперимента проводилось через 30 и 150 суток после окончания курса введения канцерогена путем декапитации. Одновременно выводились и контрольные животные соответствующего возраста. Объектом исследования служил тимус. В работе применялись следующие методы:

1. Для иммуногистохимического исследования были использованы три коммерческих моноклональных антитела фирмы Santa Cruze: к кластеру дифференцировки лимфоцитов 3 типа; к белку нейроэктодермы S-100 для идентификации дендритных клеток и некоторых популяций эпителиоцитов; к гликопротеиду пресинаптических везикул synaptophysin для идентификации нейроэндокринных клеток. Результат реакции оценивали путем подсчета позитивно окрашенных клеток на 100 клеток в десяти полях зрения, выражая результаты в процентах.

2. Окраска срезов тимуса гематоксилином и эозином для проведения морфометрических измерений.

3. Компьютерная морфометрия с использованием лицензионных программ Leica application suite 3.6.0 и Микроанализ. Данные обрабатывались статистически, достоверность определялась t-критерием Стьюдента.

Результаты исследования и обсуждение. Возрастная инволюция тимуса сопровождается структурной перестройкой органа и проявляется в постепенном уменьшении лимфоидной ткани с увеличением количества жировой и фиброзной. Атрофия железы выражается в снижении средней площади тимической дольки с 1,522 ± 0,02 мм² у крыс 6 месяцев до 0,976 ± 0,06 мм² у крыс 10 месяцев. При этом регистрируется снижение толщины коркового вещества с 0,347 ± 0,018 мм до 0,197 ± 0,014 мм, а также площади мозгового вещества с 0,597 ± 0,07 мм² до 0,468 ± 0,05 мм². Отмечается замещение тимической паренхимы жировой тканью, при этом процесс замещения идет с периферических отделов органа. При окраске гистологических препаратов антителом к кластеру дифференцировки лимфоцитов 3 типа в корковом и мозговом веществе выявляются многочисленные зрелые тимоциты. Установлено, что у молодых интактных крыс позитивную реакцию с CD 3 дают 13% клеток коркового и 56,9 % клеток мозгового вещества. По мере развития возрастной инволюции регистрируется увеличение числа этих клеток в корковом веществе до 38,7% и уменьшение их количества в мозговой зоне до 25,6%. Окраска препаратов молодых крыс к маркеру нейроэктодермы S-100 и белку нейроэндокринной дифференцировки synaptophysin выявляет немногочисленные клетки, локализованные в мозговом веществе и на границе коркового и мозгового вещества. Их количество достигает 18,4 и 12,8 соответственно в поле зрения. Через десять месяцев регистрируется достоверное увеличение числа этих клеток до 34,2 и 22,4 в поле зрения соответственно.

Введение канцерогена по указанной выше схеме вызывает развитие злокачественной опухоли толстой кишки через пять месяцев эксперимента. Опухоль имеет морфологию дифференцированной аденокарциномы. Формированию опухоли предшествует пролиферация и клеточная дисплазия крипт слизистой оболочки кишки. Морфология тимуса через один месяц после окончания введения канцерогена повторяет изменения у интактных крыс. Это выражается в постепенном снижении площади дольки и мозгового вещества, а так же толщины корковой зоны. Однако на поздних сроках канцерогенеза морфологическая картина существенно отличается от возрастной инволюции. Через пять месяцев эксперимента отмечается двукратное уменьшение площади тимической дольки и мозгового вещества, а так же толщины корковой зоны. При окраске препаратов тимуса моноклональными антителами к CD 3 отмечается достоверное увеличение числа позитивных тимоцитов в корковом веществе, тогда как количество тимоцитов в медуллярной зоне существенно не меняется в отличие от возрастной инволюции, при которой регистрировалось достоверное снижение СD 3+ тимоцитов. Окраска препаратов тимуса маркерами нейроэктодермальной и нейроэндокринной дифференцировки выявляет достоверные отличия от возрастной инволюции, которые регистрируются уже на ранних сроках после воздействия. Отмечено, что через два месяца после введения канцерогена достоверно увеличивается число клеток, дающих позитивную реакцию к белку S-100 и synaptophysin, а через пять месяцев, число этих клеток превышает значения у интактных животных в 2,5 и 3,3 раза соответственно.

Обсуждая полученные результаты можно сделать вывод, что развившаяся опухоль толстой кишки ускоряет инволютивные процессы в тимусе, что выражается в уменьшении массы органа и морфометрических показателей. Кроме того, по-видимому, имеет место токсическое влияние опухоли на костный мозг, что проявляется в нарушении поступления клеток-предшественников в железу и как следствие - относительное увеличение числа зрелых CD3+ кортикальных тимоцитов. В отличие от возрастной инволюции, при которой по мере старения происходит постепенное уменьшение числа CD3+ тимоцитов мозгового вещества, число их при канцерогенезе остается на постоянном уровне. Мы считаем, что это может быть обусловлено усилением тимопоэза в ответ на рост опухоли. На это указывает и значительное увеличение числа клеток, дающих позитивную реакцию с S-100 и synaptophysin. Известно, что в тимусе позитивную реакцию с маркером нейроэктодермальной дифференцировки S-100 дают медуллярные дендритные клетки и некоторые популяции эпителиальных клеток, входящие в состав PVS (периваскулярных пространств медуллярной зоны), а с synaptophysin – нейроэндокринные клетки медуллярной зоны, которые причисляют к клеткам АПУД серии [8]. Нейромедиаторы, выделяемые нейроэндокринными клетками, регулируют деятельность клеток микроокружения тимоцитов и секрецию ими гормонов и интерлейкинов, которые, в свою очередь, необходимы для созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов [9]. Таким образом, одновременное увеличение числа клеток, регулирующих выработку тимоцитов, но имеющих разный гистогенез и механизм действия может указывать на активизацию тимопоэза. Вероятно, эти клетки одними из первых реагируют на ранний канцерогенез и регулируют инициацию клеточного иммунного ответа на рост опухоли.

Таким образом, нами установлено, что на ранних сроках канцерогенеза развивается инволюция тимуса, которая в целом повторяет изменения при возрастной атрофии. Исключение составляют популяция клеток АПУД серии и клетки нейроэктодермального происхождения, которые, по-видимому, первыми из клеток тимуса реагируют на начальном этапе роста опухоли. Канцерогенез, соответствующий этапу инвазивной карциномы, существенно изменяет морфологию тимуса и его клеточную популяцию по сравнению с возрастной атрофией, при этом в железе наряду с инволютивными изменениями наблюдаются признаки усиления тимопоэза.

Литература:

1. Bai M., Papoudou-Bai A., Karatzias G., et al. Immunohistochemical expression patterns of neural and neuroendocrine markers, the neural growth factor receptors and the beta-tubulin II and IV isotypes in human thymus. // Anticancer Res.- 2008 - Vol. 28, №1A, - Р. 295-303.

2. Clarke S.L., Betts G.J., Plant A., et al. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells suppress anti-tumor immune responses in patients with colorectal cancer // PLoS One. -2006- Vol. 27, №1-Р.129

3. Dominguez A.L.., Lustgarten J. Implications of aging and self-tolerance on the generation of immune and antitumor immune responses // Cancer Res. - 2008 - Vol. 68, №13- Р. 5423-5431.

4. Gilbert J.M. Experimental colorectal cancer as a model of human disease. // Ann R Coll Surg Engl. - 1987 - Vol. 69, №2- Р.48-53.

5. Gress R.E., Deeks S.G. Reduced thymus activity and infection prematurely age the immune system // J Clin Invest. – 2009- Vol. 119, №10- Р.2884-2887.

6. Mailloux A.W., Young M.R. Regulatory T-cell trafficking: from thymic development to tumor-induced immune suppression. // Crit Rev Immunol. – 2010- Vol30, №5- Р.435-447.

7. Malaguarnera L., Ferlito L., Di Mauro S., et al. Immunosenescence and cancer: a review. // Arch Gerontol Geriatr. - 2001- Vol. 32, №2- Р.77-93.

8. Raica M., Encicа S., Motoc A., et al. Structural heterogeneity and immunohistochemical profile of Hassall corpuscles in normal human thymus. // Ann Anat. - 2006- Jul, Vol. 188, №4- Р.345-352.

9. Savino W., Smaniotto S., Dardenne M. Hematopoiesis. // Adv Exp Med Biol. -2005- Vol. 567- P.167-185.

10. Stewart T.J., Smyth M.J. Improving cancer immunotherapy by targeting tumor-induced immune suppression. // Cancer Metastasis Rev. -2011- Vol. 30, №1- Р.125-140.

11. Valzasina B., Piconese S., Guiducci C., et al. Tumor-induced expansion of regulatory T cells by conversion of CD4+CD25- lymphocytes is thymus and proliferation independent // Cancer Res. -2006- Vol. 66, №8- Р.4488-4495.

12. Whiteside T.L. The role of immune cells in the tumor microenvironment // Cancer Treat Res. -2006- Vol. 130- P.103-124.

13. Wolf D., Wolf A.M., Rumpold H., et al. The expression of the regulatory T cell-specific forkhead box transcription factor FoxP3 is associated with poor prognosis in ovarian cancer. // Clin Cancer Res. -2005- Vol. 11, №23- Р. 8326-8331.