Емельяненко В. А., Нынь И.В.

АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ БИФИДОБАКТЕРИЙ

Федеральное государственное унитарное предприятие «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» Федерального медико-биологического агентства, г. Санкт-Петербург, Россия

Emelyanenko V. A., Nyn I.V.

ANALYSIS OF THE STRUCTURE OF POPULATIONS OF BIFIDOBACTERIA

The Federal State Unitary Enterprise «Saint-Petersburg Research Institute of Vaccines and Sera & Enterprises for Production of Bacterial Preparations» of Federal Medical and Biologic Agency, St.-Petersburg, Russia

Бактериальные популяции представляют собой совокупность особей одного вида, обладающих общим генофондом и занимающих определённую территорию обитания. Популяции могут быть как естественные, так и искусственные, созданные в лабораторных условиях или в культиваторах. Для создания пробиотических препаратов используют искусственные популяции бифидобактерий, получаемые при культивировании определённых штаммов бактерий. В ФГУП СПбНИИВС ФМБА России для производства препарата «БИФИНОРМ^®, лиофилизат для приготовления суспензии для приема внутрь и местного применения» используется штамм Bifidobacterium bifidum 1, самый первый из штаммов, применявшихся для производства лекарственных препаратов.

В процессе работы с данным штаммом нами была выявлена его способность образовывать формы, нетипичные по физиолого-морфологическим свойствам [1]. Изменения свойств выявляются после определённых условий культивирования или спонтанно. Кроме того, было обнаружено, что и другие штаммы бифидобактерий при действии на них определённых условий культивирования способны образовывать нетипичные формы, аналогичные нетипичной форме штамма B. bifidum 1. Это явление было определено нами как диссоциация бифидобактерий.

Однако, молекулярно-генетический анализ методом ПЦР одной из нетипичных популяций, выделенной из культуры B. bifidum 1 (её мы обозначили как B. bifidum 1 (?) вар. 3), показал максимальную степень родства (98 %) с Lactobacillus plantarum, в то время как типичные популяции B. bifidum 1 имели 100 % сходства по ПЦР с Bifidobacterium bifidum (в работе использовали праймеры к 16S рРНК).

В связи с этим возникла необходимость выяснить, каковы причины появления смешанных популяций пробиотических бактерий, насколько это явление распространено, имеет ли оно биологическое значение или является артефактом, возникающим при лабораторном культивировании микроорганизмов. На данном этапе работа включала в себя следующие направления: инкубирование бифидобактерий и лактобацилл в чистых культурах, сравнение особенностей их роста; инкубирование бифидобактерий в смешанных культурах с энтеробактериями; выделение колоний разной морфологии и работа с ними.

В качестве исследуемых использовали лиофилизированные культуры производственных штаммов, коммерческие пробиотические лекарственные препараты и продукты, всего 15 образцов, относящихся, по меньшей мере, к 6 видам.

Культивирование бифидобактерий и лактобацилл для сравнения особенностей роста проводили путём посева исследуемых микроорганизмов в пробирки с 10 мл вязкой среды Блаурокка и жидкой среды МРС-1 в количестве 10 % и последующим десятикратным разведением в ряд пробирок. Засеянные пробирки помещали в термостат при (38 ± 1) °C и регистрировали характер роста через 24, 48 и 72 ч.

Оценка характера роста этих культур показала, что все они образуют в среде Блаурокка характерные единичные колонии, образующиеся в конце срока культивирования в последнем разведении. Этот срок различен – от 24 до 72 ч. В зависимости от срока появления колоний в последнем разведении все исследованные культуры можно разделить на две группы – быстрорастущие (24 ч) и медленнорастущие (72 ч). Форма колоний, которая в большинстве случаев прямо коррелировала со скоростью роста, у наблюдаемых культур тоже была представлена двумя типами – типичная для бифидобактерий в виде плотных крошек и «гвоздиков» и нетипичная – кометовидная, в виде рыхлых удлинённых тяжей разной длины, с уплотнённой «головкой» или без неё. Эти две формы культур мы обозначили как «ТМ» (типичные медленнорастущие) и «НБ» (нетипичные быстрорастущие). В некоторых случаях форма колоний была «промежуточной» – удлинённые плотные колонии появлялись на 24 ч роста. Такими характеристиками обладала культура производственного штамма
B. adolescentis МС-42, в то время как выделенные из жидкой биологически активной добавки «Биовестин» бактерии, относящиеся к этому же виду и штамму, образовывали типичные медленнорастущие колонии.

Характер роста бактерий в жидкой среде МРС-1 был отличен от роста в вязкой среде Блаурокка. Единичные колонии не выделялись, наблюдался гомогенный рост культур с образованием плотного осадка при стоянии. Интенсивность роста культур на двух средах также различалась – максимальный прирост биомассы наблюдался на среде МРС-1 только у
L. plantarum 8Р-А3 (до 10⁹ КОЕ/мл), тогда как все остальные культуры на двух средах давали максимальный рост до 10⁸ КОЕ/мл. Причём, большинство исследованных культур (кроме L. plantarum 8Р-А3) лучше росли на среде Блаурокка, некоторая часть культур давала аналогичный рост на обеих средах. Рост всех культур характеризовался повышенным уровня кислотности среды, варьирующей от 60 до 180 °T. Дополнительно проверяли способность к сквашиванию молока после роста культур в гидролизатно-молочной среде, а также прижизненные препараты культур просматривали под микроскопом при малом увеличении. Сквашивание молока различалось у штаммов из разных источников. Микроскопическая картина для всех культур характеризовалась палочковидными клетками разной длины, но коккоидных клеток не обнаруживалось.

Таким образом, было установлено наличие двух морфологических форм бактерий, отличающихся скоростью роста и формой колоний в среде Блаурокка – ТМ и НБ. Согласно этим двум формам происходит корреляция признаков: быстрорастущие культуры образуют нетипичные колонии, рост быстрорастущих культур на средах Блаурокка и МРС-1 чаще аналогичен; при длительном хранении наблюдается сохранение жизнеспособности клеток в НБ культурах и снижения её до полного отсутствия роста в ТМ культурах. Эта особенность, по всей вероятности, связана с устойчивостью бактерий к негативному действию аутометаболитов, главным образом веществ кислой природы [2].

На данной стадии исследования объяснение этим явлениям дать сложно. Можно с уверенностью констатировать, что бифидобактерии разных видов и штаммов существуют в двух морфологических формах – НБ и ТМ. Лактобациллы относятся к форме НБ. По свойствам форма НБ у бифидобактерий очень похожа на лактобациллы.

На следующем этапе работы было проведено совместное культивирование бифидобактерий типичной морфологии (B. bifidum 1 СПбНИИВС; B. bifidum 1 «Экополис», Коврово; B. bifidum 1 вар. «ТМ из НБ»; B. bifidum 1 или 791,Томск; B. bifidum, B. longum «Нормофлорин»;
B. adolescentis МС-42 «Биовестин»; B. longum) с энтеробактериями (Shigella flexneri 170, Escherichia coli 157, E. coli М-17, Proteus mirabilis 273, Salmonella enterica bv. mission, Salmonella sp. («культура Мережковского»)), последующее удаление энтеробактерий и анализ свойств оставшихся культур. В результате из 42 вариантов смешанных культур было отобрано пять, которые показали наличие НБ форм после дальнейшего роста культур в ряду разведений на среде Блаурокка с налидиксовой кислотой (для удаления энтеробактерий из смеси). Результаты представлены в таблице:

Компоненты смешанной культуры		Учёт колоний бифидобактериального компонента после удаления энтеробактерий, КОЕ/мл, ТМ или НБ
Бифидобактерии	Энтеробактерии	Через 24 ч	Через 48 ч	Через 120 ч
B. bifidum 1 (СПбНИИВС)	E. coli М-17	2 × 10^7 НБ	2 × 10^7 НБ	Гомогенный рост до разведения 10^-8
B. bifidum 1 («Экополис», Коврово)	S. flexneri 170	2 × 10^4 НБ	2 × 10^4 НБ	Гомогенный рост до разведения 10^-5
B. bifidum 1 вар. «ТМ из НБ»	S. flexneri 170	8 × 10^6 НБ	2 × 10^7 НБ	Гомогенный рост до разведения 10^-8
B. bifidum 1 вар. «ТМ из НБ»	E. coli М-17	8 × 10^5 НБ	2 × 10^6 НБ	Гомогенный рост до разведения 10^-7
B. adolescentis МС-42 («Биовестин»)	E. coli 157	2 × 10^6 НБ	2 × 10^6 НБ	Гомогенный рост до разведения 10^-7

Таким образом, из типичных медленнорастущих форм бифидобактерий штаммов B. bifidum 1 и B. adolescentis МС-42 были вновь получены нетипичные быстрорастущие формы после совместного культивирования их с энтеробактериями. В данном случае штаммами-модификантами послужили E. coli М-17 (пробиотический непатогенный штамм), E. coli 157 (энтеропатогенный штамм), S. flexneri 170 (энтеропатогенный штамм). Изменённые нетипичные быстрорастущие формы бактерий по морфологическим и культуральным признакам были аналогичны НБ-формам, полученным у B. bifidum 1 ранее.

Как мы уже указывали выше, молекулярно-генетический анализ полученной ранее НБ формы B. bifidum 1 (?) вар. 3 определил её принадлежность к Lactobacillus plantarum. Вновь полученные формы такому анализу ещё не подвергались. Свойства L. plantarum 8Р-А3 и исследованных нами НБ форм во многом совпадают. Существует разница в предпочтении питательной среды – ни одна из культур не показывала на среде МРС-1, благоприятной для L. plantarum 8Р-А3, максимального прироста биомассы. В то же время, L. plantarum 8Р-А3 показывал слабый рост на среде Блаурокка. Можно утверждать, что если анализируемая методом ПЦР культура B. bifidum 1 (?) вар. 3 принадлежит к виду
L. plantarum, то не является штаммом L. plantarum 8Р-А3.

Следовательно, необходимо провести тщательный анализ пробиотических бактерий на популяционном и генетическом уровне, использовать результаты биохимических и экологических исследований. В настоящее время существуют различные способы идентификации бифидобактерий с помощью ПЦР, использующие разные праймеры – к
16S рРНК, другие генетические мишени, результаты которых не всегда совпадают и часто приводят к ложно-положительным или ложно-отрицательным результатам [3]. Есть данные о наличии плазмид в генетическом аппарате бифидобактерий [4].

В наблюдаемом нами сложном явлении невозможно однозначно выявить причины и следствия. Следует усилить внимание к популяционной организации бактерий, чтобы объяснить причину их гетерогенности. Только популяционно-коммуникативный, экологический подход к данной проблеме сможет разрешить её. Необходимо ставить акценты не на внутривидовые, а в основном на межвидовые взаимодействия в ассоциациях, экосистемах, биосфере в целом [5].

Литература

1. Королюк А. М., Младзиевская Ю. А., Емельяненко В. А. Феномен приобретения полезных свойств производственными штаммами бифидобактерий при совместном культивировании с некоторыми энтеробактериями // 2-я Международная конференция «Наука – Бизнес – Образование; Биотехнология – Биомедицина – Окружающая среда» (Тезисы докладов), 10–13 мая, 2005 г., Пущино. – Пущино, 2005. – С. 24–26.

2. Емельяненко В. А., Королюк А. М. Зависимость жизнедеятельности бифидобактерий от кислотности среды культивирования // Наука и современность – 2010. – № 2–3. – С. М31.

3. Пиксасова О. В. Новый подход к молекулярной диагностике бифидобактерий: Автореф. дис... канд. биол. наук: 03.00.07. – Москва, 2009. – 25 с.

4. Шкопоров А. Н. Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения: Автореф. дис... канд. биол. наук: 03.00.07. – Москва, 2008. –
24 с.

5. Кировская Т. А. Популяционно-коммуникативные подходы в отечественной микробиологии второй половины ХХ века (историко-научный анализ): Дис... канд. биол. наук: 03.00.10. – Москва, 2005. –
188 с.