Нынь И. В.

ИЗУЧЕНИЯ ВЛИЯНИЯ МИКРОГРАВИТАЦИИ НА СИНТЕЗ ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА B РЕКОМБИНАНТНЫМИ ДРОЖЖАМИ

Федеральное государственное унитарное предприятие «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» Федерального медико-биологического агентства, г. Санкт-Петербург, Россия

Nyn I. V.

EFFECT OF MICROGRAVITY ON THE SYNTHESIS OF HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN BY RECOMBINANT YEAST

The Federal State Unitary Enterprise «Saint-Petersburg Research Institute of Vaccines and Sera & Enterprises for Production of Bacterial Preparations» of Federal Medical and Biologic Agency, St.-Petersburg, Russia

Объектом исследования служили дрожжи-сахаромицеты, рекомбинантные продуценты поверхностного антигена вируса гепатита B, испытавшие влияние факторов космического полёта в космическом эксперименте «Антиген». Для космических экспериментов программы использовали 4 штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, хранящихся в ФГУП СПбНИИВС ФМБА России. Эти штаммы обозначены как S. cerevisiae D24, S. cerevisiae D25, S. cerevisiae D26 и S. cerevisiae D27. Штаммы как реципиенты получены из производственного штамма S. cerevisiae ВКПМ
Y 1678, продуцента поверхностного антигена вируса гепатита B, запатентованного Санкт-Петербургским научно-исследовательским институтом вакцин и сывороток и предприятием по производству бактерийных препаратов [1]. Штаммы трансформированы плазмидой pSc3954, содержащей нормальную аллель гена LEU2 и клонированную копию вирусного гена HBsAg под PHO5-промотором и копию bla-лактамазы E. coli.

В процессе работы проводились исследования по культивированию дрожжей до и после экспонирования в условиях микрогравитации, выделению и определению активности HBs-антигена, оценке его митотической стабильности, определению уровня гетерогенности популяций.

В результате проведения серии космических экспериментов установлено, что время пребывания на борту оказывает различное влияние на характер изменений, произошедших с клетками S. cerevisiae: у сохранивших жизнеспособность клеток не обнаружено ярко выраженных отличий ни в морфологии клеток (округлые, с хорошо различимым ядром, размер около 7 мкм), ни в характере деления (наличие не более двух почек) при кратковременных полётах.

В то же время нельзя не заметить тенденцию снижения показателей жизнеспособности клеток, находившихся на борту космического корабля в жидком состоянии и на поверхности плотной агаризованной среды при увеличении сроков полёта. Находящиеся в состоянии анабиоза лиофилизированные культуры способны пережить подобный стресс.

Пребывание в условиях полета культур в жидком состоянии снижает их жизнеспособность, тогда как лиофильно высушенные штаммы проявляют стабильность и устойчивость к стрессовым воздействиям космического полета по этому признаку (уровень накопления биомассы разными штаммами
S. cerevisiae при росте в жидкой среде после пребывания в условиях космического полёта в лиофильно высушенном состоянии снижается на 1–3 порядка в зависимости от штамма).

После кратковременного пребывания на борту и последующих 24 часов роста варианты земных и лётных серий не отличались между собой по удельной скорости роста клеток μ=0,17 – 0,21 ч, по времени выхода на стационарную фазу роста – 16-18 ч, по максимальному урожаю клеток для соответствующих сред (для HP_i – 2,1–2,5 × 10⁸ кл./мл, для HP_i' –
1,6–2,0 × 10⁸ кл./мл).

Кратковременное пребывание на борту культур в жидкой среде может служить дополнительным источником поиска новых свойств штаммов, тем более, что кратковременный полёт (7–10 суток) не снижает жизнеспособности клеток дрожжей.

Полученные в земных условиях данные по оптимизации параметров культивирования штамма-продуцента сохраняют свою актуальность и для лётных серий штаммов: в модифицированной среде HP_i' уменьшается максимальный урожай клеток при сохранении значений титра антигена, что облегчает процесс очистки антигена. Подобная закономерность даёт возможность предполагать, что факторы космического полёта не всегда обладают сильным мутагенным и модифицирующим действием, что даёт возможность планировать космические эксперименты с большой достоверностью и приближённо к земным условиям. И это также позволяет использовать технологически важные изменения со штаммами S. cerevisiae, наблюдаемые после пребывания в условиях космического полёта.

Изучение кратковременно побывавших в космосе лиофилизированных и жизнеспособных жидких культур показало, что стабильность антигенных характеристик HBs-антигена не зависит от времени хранения в условиях полета и определяется главным образом свойствами штамма. Среднестатистические показатели экспрессии гена HBsAg в клетках лётных серий не отличались от земных. Очевидно, что кратковременное стрессовое состояние, связанное с транспортировкой и воздействием факторов космического полёта, не оказывает негативного влияния на уровень гетерологического синтеза в анализируемых штаммах.

По антигенным характеристикам среди наземных и лётных образцов были выявлены три фенотипические группы:

HBsAg⁺ BLA⁺ – со среднестатистическими показателями экспрессии;

HBsAg⁺⁺ BLA⁺⁺ – с превышением уровня экспрессии на 2 титра;

HBsAg^+– BLA^+– – с уменьшением уровня экспрессии на 2 титра (BLA-фенотип показывает уровень активности β-лакатамазы).

В случае лётных серий штаммов S. cerevisiae D24 и S. cerevisiae D25 происходит статистически достоверное увеличение числа клонов фенотипических групп с крайними показателями уровня экспрессии. Увеличение степени гетерогенности при сохранении типов фенотипических групп свидетельствует о наличии факторов в условиях космического полёта, усиливающих генетическую нестабильность генно-инженерного синтеза. Данное явление имеет положительную сторону, так как в популяции растёт число клонов с увеличением продукции вирусного белка, которые могут рассматриваться как перспективные суперпродуценты в промышленных масштабах. Следует отметить сохранение высокого уровня митотической стабильности в случае штаммов S. cerevisiae D26 и S. cerevisiae D27.

При оценке влияния факторов космического полёта (а в данном случае мы склонны считать микрогравитацию важнейшим из действующих в серии наших космических экспериментов) на биотехнологические характеристики дрожжей-сахаромицетов, продуцентов HBs-антигена вируса гепатита B, наибольшее влияние оказывают факторы культивирования.

Полученные результаты показывают возможность адекватного существования микроорганизмов на борту космических кораблей в составе «биотехнологических фабрик», которые в будущем будут сопровождать межпланетные длительные полёты. Космические эксперименты продемонстрировали, что отбор культур микроорганизмов с нужными свойствами можно вести и на Земле, и в космосе.

Литература

1. Нестерова Л. А., Нынь И. В., Викторова Л. М., Грива М. А.,
Потапчук М. В., Смирнов О. И.; Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y 1678, продуцент поверхностного антигена вируса гепатита B: Пат. 2143494 Россия, МПК⁶ C12N 015/51, C12N 015/81, C12N 001/16,
C07K 014/02, A61K 039/29. – № 98104203.