Биологические науки/9 Биохимия и биофизика

 

д.т.н. Тырсин Ю.А.1, к.т.н. Шеламова С.А.2

Московский государственный университет пищевых производств, Россия

Воронежский государственный университет инженерных технологий, Россия

 

Кинетика ферментативного гидролиза триацилглицеролов

 

В настоящее время в биотехнологии активно проводятся исследования биокатализа в средах, содержащих органические растворители. Это не удивляет, так как он имеет потенциальные преимущества, а именно 1) относительно высокая растворимость многих соединений в органических растворителях; 2) возможность полностью обращать гидролитические реакции в реакции синтеза.

Согласно данным литературы активность биокатализаторов зависит от полярности растворителя [1]. В качестве меры полярности растворителей используется log коэффициента распределения в стандартной двухфазной жидкой системе октанол-вода – log P. сильно гидрофильные растворители с log P < 2 инактивируют или денатурируют ферменты; менее водорастворимые с log P от 2 до 4 слабо деформируют водное окружение биокатализатора, и влияние их на активность довольно непредсказуемо; растворители с log P > 4 в силу большой полярности не способны взаимодействовать с водной оболочкой и оставляют фермент в активном состоянии. Исключение составила панкреатическая липаза – они сохраняла активность в практически всех испытуемых растворителях; не выявлено строгой корреляционной зависимости между активностью и log P [2]. Экспериментальные исследования ферментативного катализа в растворителях показывают, что влияние их зависит от особенностей фермента, полярности субстратов, вида носителя для иммобилизации ферментов.

Нами исследован гидролиз триацилглицеролов под действием иммобилизованного препарата липазы Rh. oryzae 1403 в водной среде и в системах с органическими растворителями.

Триацилглицеролы с высокой температурой плавления и находящиеся в твердом состоянии при оптимальной температуре действия липазы Rh. oryzae 1403 (35 ºС), не подвергались превращениям. Поэтому их гидролиз был проведен в системе с растворителями с различной полярностью – гексаном (log P 3,5) и бутаноном (log P 0,28).

Полученные данные представлены в таблице.

Таблица

Кинетические характеристики гидролиза триглицеридов

иммобилизованной липазой Rh. oryzae 1403

Субстрат

Vmax , mМ×мин-1×г-1

KM, mМ

Vmax /KM, г-1×мин-1×

Без растворителя

Трибутирин

505±30

810±52

0,62±0,04

Трикапроин

620±37

765±46

0,81±0,05

Трикаприлин

780±48

620±40

1,26±0,08

Трикаприн

910±54

510±28

1,78±0,1

Триолеин

1810±91

390±25

4,64±0,3

Трилинолеин

2030±110

350±20

5,80±0,4

Растворитель – гексан

Трилаурин

1150±61

720±43

1,60±0,09

Тримиристин

1390±82

980±59

1,42±0,08

Трипальмитин

1520±91

1190±72

1,28±0,07

Тристеарин

1740±104

1450±87

1,20±0,07

Растворитель – бутанон

Трилаурин

450±32

920±52

0,49±0,02

Тримиристин

720±45

840±48

0,86±0,04

Трипальмитин

890±54

680±10

1,31±0,07

Тристеарин

1020±67

610±35

1,67±0,08

 

С увеличением длины цепи жирной кислоты в составе ТАГ скорость гидролиза возрастала вне зависимости от системы реакции. Это согласуется с результатами исследований липаз, в которых показано, что переходные состояния ацилирования-деацилирования не изменяются при переходе от растворителя к растворителю [3]. Характер изменения KM определялся полярностью среды реакции: в воде и бутаноне значения KM уменьшались с длиной цепи, а в гексане – увеличивались. Таким образом, в неполярном растворителе требуется преодолеть более высокий энергетический барьер для связывания субстрата с ферментом. Судя по константам скорости второго порядка – Vmax /KM , специфичность к кислотам с большой длиной цепи проявлялась в воде и полярном растворителе; в неполярном растворителе наблюдалось обращение специфичности к длине цепи жирной кислоты. Эффективность гидролиза в бутаноне была ниже в 2,8–3,6 раз по сравнению с водной средой, что объясняется значительным снижением скорости реакции.

Уменьшение эффективности гидролиза триглицеридов в гексане главным образом связано с возрастанием константы Михаэлиса в 1,4–3,7 раз. Эти результаты согласуются со свойством разделения гидрофобных субстратов между средой реакции и активным центром липазы. Это разделение уменьшается до минимума при увеличении гидрофобности и субстрата, и растворителя, требуя таким образом большей концентрации субстрата для насыщения фермента и следовательно, получаются более высокие значения KM. Каталитическая эффективность уменьшается и приводит к затруднению взаимодействия фермента и субстрата.

 

Литература:

1. Rules for Optimization of Biocatalysis in Organic Solvents [Text] / C. Laane, S. Boeren, K. Vos, C. Veeger // Biotechl. Bioeng. – 1987. –V. 30. – P. 81–87

2. Zaks, A. The effect of water on enzyme action in organic media [Text] / A. Zaks, A. Klibanov // J. Biol. Chem. – 1988. – V. 263, № 17. – Р. 8017–8021

3. Wescott, C. R. The solvent dependence of enzyme specificity [Text] / C. R. Wescott, A. M. Klibanov // Biochim. Biophys. Acta. – 1994. – V. 1206. – P. 1-9

 

 

Zaks & Klibanov изучили реакцию трансэтерификации между трибутирином и гептанолом с участием различных липаз в почти безводных растворителях. Зависимости активности от log P для липаз дрожжей и грибов имели S-форму (рис. 1). Подобные сведения сообщены для 20-β-гидроксистероид-дегидрогеназы и для ксантиноксидазы.

По мнению Zaks & Klibanov, возможны различия в конформации этих трех ферментов: внешняя часть панкреатической липазы может быть более гидрофобной и необходимая вода связывается с молекулой сильнее.

[454]

 

Однако в продолжение такого толкования получается, что растворители, насыщенные водой, должны быть безвредными для биокатализаторов. Но практически всегда растворитель бывает насыщен водой, либо до проведения реакции, либо в реакционной среде. Поэтому более верное объяснение подавления активности ферментов в присутствии отдельных растворителей видят в деформации хрупкого водного слоя, стабилизирующего биокатализатор или в вытеснении этого слоя. Для дополнительного доказательства деформирующего действия растворителей было проведено сравнение их растворимости в воде с log P. Результаты, полученные для примерно 30 растворителей (табл. 1), позволили разделить их на три группы.

Таблица 1

Максимальная растворимость органических растворителей

в воде и значения log P

Коэффициент полярности

Растворимость в воде (20 ºС), масс. %

log P ≤ 2

> 0,4

2 < log P< 4

0,04–0,4

log P ≥ 4

< 0,04