Биологические науки / 11. Биоинженерия и биоинформатика

Д.б.н. Мельнов С.Б., Снытков Е.В.

Международный государственный экологический университет

им. А.Д. Сахарова, Минск, Беларусь

Векторные системы создания ГМ культур

и ГМ организмов

Основной метод создания ГМ культур и ГМ организмов – введение генетической информации в растительные клетки. Для введения такой информации сегодня существуют различные векторные системы

1. Введение ДНК в клетки растений с помощью Ti- и Ri-плазмид. A. tumefaciens вызывает образование опухолей стебля двудольных растений – так называемых корончатых галлов. Бактерии прикрепляются к клеткам растения в местах повреждений. Сайтами связывания на поверхности бактерий, видимо, являются молекулы β-глюкана и О-антигенной цепи липополисахарида внешней мембраны. Способность A. tumefaciens индуцировать у растений образование опухолей типа "корончатого галла" коррелирует с наличием у них Ti-плазмиды. Трансформация является результатом стабильного ковалентного включения (инсерции или интеграции) сегмента Т-ДНК большой плазмиды (pTi – tumor inducing или pRi — root inducing) бактерий в ядерную ДНК растительной клетки.

Другой вид агробактерий – A. rhizogenes, – вызывает заболевание, именуемое "бородатый корень", при котором в зоне повреждения корня образуется масса новых корешков. A. rubi обычно индуцируют неорганизованные опухоли (тератомы), штаммы A. radiobacter авирулентны. Ткани корончатых галлов содержат более высокие уровни ауксина и цитокининов. Еще одно наследуемое изменение в клетках корончатых галлов — синтез опинов, производных аргинина, обнаруженных лишь в определенных опухолевых линиях. Другими опухолевыми линиями синтезируется соединение нопалин, также производное аргинина.

Подробная информация о структуре плазмид Agrobacterium получена путем их рестрикционного или физического картирования. В результате обнаружено четыре основных области гомологии между октопиновой и нопалиновой плазмидами. Две консервативные (области А и D) вовлечены в онкогенность; еще одна (В) соответствует области контроля репликации плазмиды; последняя (С) кодирует функции конъюгативного переноса. Кроме Т-ДНК в плазмидах имеются: область, кодирующая функцию конъюгации (Tra), область репликации (Ori V) и область вирулентности (Vir). Последовательности Ti-плазмиды, фланкирующие Т-ДНК (пограничные или концевые области), играют важную роль в интеграции в растительный геном и содержат повторы по 24—25 п. н. Делеция левой границы Т-ДНК не влияет на опухолеобразование, но удаление правой пограничной области приводит к утрате вирулентности. Делеция правого повтора или его части приводит к потере способности Т-ДНК включаться в растительную ДНК. Учитывая важную роль концов Т-области в переносе Т-ДНК, можно предположить, что любой сегмент ДНК, встроенный между этими концами, может быть перенесен в растения как часть Т-ДНК.

Плазмиды модифицируют таким образом, чтобы удалить все онкогенные последовательности, так как они не принимают участия ни в переносе, ни в интеграции в геном клетки-хозяина. На место этих генов можно встроить чужеродную ДНК, а плазмида теряет свои онкогенные свойства. Неонкогенные Т-ДНК, присутствующие в растениях-регенерантах, передаются согласно законам Менделя.

Agrobacterium имеет широкий круг растений-хозяев и может инфицировать практически все двудольные растения. При соблюдении определенных условий агробактерии могут инфицировать и однодольные растения, в частности представителей таких семейств, как Amaryllidaceae, Liliaceae, Gramineae, Iridaceae и некоторых других. Однако существуют определенные ограничения круга хозяев для различных штаммов. Различные сорта одного и того же растения также могут иметь различную чувствительность к данному бактериальному штамму.

В природе такое заражение невозможно, что обуславливается отсутствием соответствующих рецепторов, необходимых для взаимодействия с бактериями. Другим фактором, препятствующим инфицированию однодольных агробактериями, возможно, является отсутствие в клетках растений низкомолекулярных индукторов вирулентности Agrobacterium, например ацетосирингона, которые обычно присутствуют в клеточном соке при поранении двудольных растений.

2. Коинтегративные и бинарные векторы

Для введения в растение Ti-плазмидных последовательностей, содержащих нужный ген, разработаны два метода. Первый – метод «промежуточных векторов» (cis-, или коинтегративных векторов) – основан на использовании гомологичной рекомбинации между плазмидой кишечной палочки pBR 322 и Ti-плазмидой агробактерии. Т-ДНК вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в плазмиду pBR 322 для клонирования в Е. соli. Бактерии, содержащие плазмиду с Т-ДНК, размножают, после чего ее выделяют. Затем в клонированную Т-ДНК с использованием рестриктаз встраивают нужный ген. Эту рекомбинантную молекулу, содержащую Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в большом количестве, то есть клонируют в E. Coli, и вводят в клетки агробактерии, несущие полную Ti-плазмиду. Между Т-сегментами нативной Ti-плазмиды и промежуточного вектора происходит гомологичная рекомбинация. В результате этого Т-ДНК со встроенным геном включается в нативную Ti-плазмиду, замещая нормальную ДНК. Получаются клетки А. tumefaciens, несущие Ti-плазмиды со встроенными в Т-сегмент нужными генами. Далее их перенос в клетки растения осуществляется обычным способом, характерным для агробактерий.

Второй метод основан на создании системы trans-, или бинарных (двойных) векторов. Эти векторы не имеют гомологии с Т-ДНК. Они обязательно содержат сайт (ori) плазмиды с широким кругом хозяев либо ori-сайты как Agrobacterium, так и E.coli, благодаря чему способны автономно реплицироваться в обоих этих микроорганизмах. При создании современных трансгенных сортов растений в основном используют бинарные векторные системы. Сам вектор представляет собой плазмиду, которая содержит сайт начала репликации (ori), а также по 25 п.н. левого и правого краев Т-ДНК, между которыми расположены нужные исследователю гены с соответствующими регуляторными элементами. Конструируют их исключительно методами технологии рекомбинантных ДНК и их можно клонировать в E.coli. Примером плазмидного бинарного вектора является использование вектора pMON10117 при создании томатов с удлиненным сроком созревания. По внешнему периметру плазмиды отмечены сайты рестрикции соответствующих рестриктаз, а также номера нуклеотидов, начиная с правого края. По внутреннему периметру – последовательность генетических элементов, содержащихся на плазмиде. В ДНК трансгенных растений включена часть плазмиды, ограниченная левым и правым краями, – Т-ДНК. Ori-322 и ori-V-сайты начала репликации плазмиды соответственно в E.coli и A. Tumefaciens. После клонирования, изучения и отбора нужных конструкций генов отобранные бинарные векторы переносят в специальные штаммы, созданные на основе высоковирулентных штаммов Agrobacterium (как правило, A.tumefaciens). Характерной особенностью этих штаммов является то, что они имеют так называемую “разоруженную” vir-плазмиду, которая содержит интактную vir-область, но у которой полностью отсутствует Т-область. Привнесенный в Agrobacterium бинарный вектор способен автономно реплицироваться в ней благодаря наличию ori-сайта от плазмиды с широким кругом хозяев. Вследствие же наличия “разоруженной” vir-плазмиды он может успешно переноситься и встраиваться в геном клеток растений.

При разработке бинарных векторных систем используется важнейшая особенность механизма агробактериальной трансформации, согласно которой vir-область Ti-плазмиды обеспечивает перенос Т-области из бактерий в растения, но сама при этом в растения не попадает. С другой стороны, в процессе переноса Т-области существенным является наличие очень небольшой части Т-ДНК: по 25 п.н. ее левого и правого краев. Остальная часть Т-ДНК, в том числе все онкогены и гены, кодирующие образование опинов, для процесса переноса Т-ДНК несущественны. Они выполняют в нем пассивную роль и могут быть безболезненно заменены любыми другими генами.

Для введения сконструированных Ti-плазмид в растительную клетку может быть использовано несколько методов. Наиболее простой из них природный способ — это инокуляция сконструированных штаммов в поврежденные участки растения. Другой метод состоит в трансформации протопластов путем кокультивирования их с агробактериями.

Встраивание в ДНК реципиентной клетки донорского гена сопряжено с определенными трудностями, главные из которых – обеспечение точной адресной вставки, а также их нормального функционирования – экспрессии. Еще более важной является проблема генетического риска, возможного получения мутантов с содержанием токсичных или аллергенных для человека белков или других опасных соединений. Дестабилизация генома при трансгенезе может происходить не только за счет обогащения генома новыми генами или мутагенного эффекта вставки, но и в силу индуцирования эндогенных систем рекомбинации и активации «молчащих» генов. Это делает теоретически возможным возникновение опасных для здоровья и жизни человека генотипов. Риск получения мутантов значительно возрастает при использовании искусственных, синтетических генов у трансгенных растений, животных и микроорганизмов с улучшенными или новыми свойствами.

Экспертная система оценки опасностей и рисков трансгенеза должна включать два основных компонента: 1) интерактивную базу данных на основе текущего мета-анализа публикуемых результатов; 2) математическую модель, учитывающую результаты мета-анализа и способную оценить биобезопасность вновь синтезируемых векторов как в отношении горизонтального, так и возможного вертикального переноса.