Биологические науки/ 6. Микробиология

К.б.н, Андрусенко С.Ф., к.б.н. Денисова Е.В., Терещенко Ю.С.

Северо-кавказский федеральный университет

Оптимизация биотехнологии регенерации питательных сред для бифидогенной микрофлоры

Бифидобактерии являются одним из основных показателей нормального функционирования кишечника, вследствие чего на их основе создаются жидкие биопрепараты для лечения людей с дисфункциями кишечника. Получают данные микроорганизмы путем выращивания их на питательных средах, а так как прирост биомассы имеет большое значение, очень важно подобрать наиболее эффективные стимуляторы роста бактерий. В связи с чем актуальным является поиск биологических объектов для использования в качестве стимуляторов роста бифидобактерий.

Целью работы являлось исследование количественного потребления бифидобактериями определенных компонентов БФ – среды и стимулирующего влияния на рост различных концентраций фукозного сиропа, клеточного сока каллуса лаванды 7-, 15- и 27- дневного возраста и культуральной жидкости агаровой среды выращивания каллуса лаванды 7- и 15- дневного возраста.

Было проведено исследование БФ – среды на содержание следующих компонентов (до и после посева бифидобактерий): 1. Полипептиды; 2. Общий азот; 3. Глюкоза; 4. Лактоза; 5. Зола; 6. Тяжелые металлы; 7. Аскорбиновая кислота; 8. рН.

По данным тонкослойной хроматографии выяснили, что содержание глюкозы и лактозы в образце после посева бифидобактерий уменьшились в сравнении с образцом до посева бифидобакткрий.

Анализ на металлы проводили на атомно-адсорбционном спектрофотометре. Для этого образцы подвергали озолению. Установлено, что наблюдается присутствие в пробе (БФ - среде), до посева бифидобактерий, следующих металлов: Zn, Cu, Mn, Pb, Fe, Ni, Cа. После посева бифидобактерий наблюдается снижение содержания таких металлов как Pb, Fe и увеличилось содержание Zn, Cu, Mn, Ni, Cа.

Установлено, что после посева бифидобактерий уровень аскорбиновой кислоты значительно уменьшился с 6,804 до 0,567.

В качестве посевного материала использовали лиофильно высушенный лечебно-профилактический препарат бифидумбактерин, который содержал не менее 10⁷ живых бифидобактерий штамма B.bifidum № 1 в 1 дозе. Результаты роста учитывали двумя способами: 1) Визуально; 2) С помощью фотометра КФК.

Визуальный способ учета результатов роста - Через 2-3 суток культивирования посевов их визуально смотрели в проходящем свете. Отмечали наличие роста бифидобактерий. Способ учета результатов роста с помощью фотометра КФК - через 3 суток культивирования посевов, проводили определение оптической плотности (Д) в опытных и контрольной К1 пробирках на фотометре КФК при λ = 590 нм в кюветах №10. Все культуральные жидкости (посевы) перед определением Д₅₉₀ фильтровали через сито для освобождения от образующейся пленки. Затем из каждого фильтрата отбирали аликвоты по 1,0 мл, переносили их в чистые пробирки и добавляли по 4 мл дистиллированной воды, т.е. разводят в соотношении 1:4 (в 5 раз). Прибор настраивали на контроль К2 (не засеянный), тоже разведенный 1:4. Определив величину Д₅₉₀ во всех опытных и контрольной К1 пробирках, проводили расчет концентрации (С) общего количества м.к. (в млрд.) в мл среды, так называемую оптическую концентрацию.

Находили разницу между величиной концентрации м.к. в мл контрольной К1 БФ-среды (С_К1) и величиной концентрации м.к. в мл каждой опытной БФ-среды (С_оп), т.е С_{(К1–оп1)}, С_{(К1–оп2)} и т.д. Концентрацию С м.к. в мл в контроле К1 принимали за 100 % . Найденные разницы С_(К1-оп), т.е. прирост или снижение концентрации м.к. в мл опытных БФ-сред, выражали в % по отношению контролю К1.

Определение минимальной стимулирующей концентрации фукозного сиропа. Фукозный сироп рН 7,0-7,2 в конечной концентрации 43,5, 21,7, 10,8 и 2,7% подавлял рост бифидобактерий в БФ-среде. При других концентрациях: 1,35 и 0,68% он оказывал небольшое стимулирующее влияние.

Проводилось определение минимальной стимулирующей концентрации клеточного сока каллуса лаванды. Минимальная стимулирующая концентрация клеточного сока каллуса лаванды 7-дневного возраста на рост бифидобактерий в регенерированной БФ-среде равна 6,25%. Прирост бифидобактерий при этом составляет 79,2%. Минимальная стимулирующая концентрация культуральной жидкости среды выращивания каллуса лаванды 7-дневного возраста составляет 0,78%. Прирост бифидобактерий составляет 127,9%.

Минимальная стимулирующая концентрация клеточного сока каллуса лаванды 15-дневного возраста при тех же условиях равна 3,12%. Прирост бифидобактерий составляет 139,9%. Минимальная стимулирующая концентрация культуральной жидкости среды выращивания каллуса лаванды 15-дневного возраста равна 0,78%. Прирост бифидобактерий составляет 75,9%.

Минимальная стимулирующая концентрация клеточного сока каллуса лаванды 27-дневного возраста на рост бифидобактерий в регенерированной БФ-среде равна 3,12%. Прирост бифидобактерий составляет 177,0%.

Проведен сравнительный анализ по содержанию в БФ-среде уровня различных компонентов до и после посева бифидобактерий: полипептиды: 3,8 – 2,16 зола: 13,67 – 12,76 общий азот: 0,55 – 0,35 рН: 6,25 – 4,02 аскорбиновая кислота: 6,804 – 0,567.

Таким образом, в качестве возможных стимуляторов роста бифидобактерий испытаны следующие биологические материалы растительного происхождения: - фукозный сироп рН 7,0-7,2, полученный из водорослей рода Fucus; - клеточный сок каллуса лаванды 7, 15 и 27-дневного возраста; - культуральная жидкость агаровой среды выращивания каллуса лаванды 7 и 15-дневного возраста.

Литература

1. Бифидобактерии и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве. Сборник научных трудов. - М., 1986. – 208 с.

2. Векслер И.Г. Биологически активные полисахариды, как неспецифические стимуляторы резистентности организма // Микробиология, эпидемиология и клиника инфекционных болезней. – 1981, Т.3, №4. – С.27-28.

3. Елинов Н.П. Химическая микробиология. – М.: Мир, 1989. – 361 с.

4. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии.- М.: Медгиз, 1950. - 252 с.

5. Новик Г.И. Исследование структурно-функциональной организации бифидобактерий. // Микробиология.- М., 1998, Т.67. - №3. - С.376-383.

6. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериоз кишечника. - М., 1984. – 60 с.

7. Физико – химические методы контроля ингредиентов, питательных сред и биопрепаратов. // Методическое пособие для биофабрик и ветеринарных лабораторий. Под редакцией проф. Колесова С.Г. – М.: Наука, 1970. – 258 с.