¹Василькевич А.И., ²Биричевская Л.Л., ²Лузина Е.Б., ¹Кисель М.А.,

²Зинченко А.И.

¹Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск

²Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ³¹Р-ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПРЕВРАЩЕНИЯ ФОСФАТИДИЛХОЛИНА В ФОСФАТИДИЛСЕРИН

Реакция трансфосфатидилирования, катализируемая фосфолипазой D (ФЛД), широко применяется в синтезе разнообразных фосфолипидов для пищевой и фармацевтической промышленности [1]. К числу таких фосфолипидов относится малораспространенный в природных источниках фосфатидилсерин (ФС), привлекающий в последние годы особое внимание исследователей из-за своих уникальных фармакологических свойств.

ФС используется в качестве пищевой добавки, которая способна поддерживать ряд функций головного мозга, связанных с памятью и способностью к обучению. Отмечено, что ФС может сглаживать симптомы депрессии, физического, умственного и эмоционального стресса, а также обладает эргогенными свойствами [2, 3]. Данное соединение может применяться в качестве средства против остеопороза [4], имеет перспективы применения в косметологической промышленности [5, 6]. Недавние исследования показали возможность применения данного фосфолипида в качестве компонента противомикробных препаратов [7], а также для лечения последствий инфарктов и инсультов [8]. Дефицит ФС в организме невозможно устранить за счет питания, хотя он содержится во многих пищевых продуктах, но в незначительных количествах. Выделение ФС из наиболее богатого этим фосфолипидом мозга крупного рогатого скота с последующим использованием в качестве субстанции пищевой добавки сопряжено с опасностью контаминации прионными инфекциями. Более перспективным методом получения ФС является ферментативный синтез с использованием катализируемой ФЛД реакции трансфосфатидилирования, в которой доступный фосфатидилхолин (ФХ) служит донором фосфатидильного остатка, а L-серин – акцептором.

Наличие удобного и надежного метода количественного и качественного анализа смесей фосфолипидов при проведении реакции трансфосфатидилирования позволяет проводить ее мониторинг, необходимый для подбора оптимальных условий и параметров реакции. Ранее с этой целью широко применялся метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) с обнаружением исходного фосфолипидного субстрата и продукта специфическими реагентами. ТСХ – удобный экспресс-метод качественного анализа фосфолипидов, однако, при необходимости количественного анализа он значительно усложняется, а для получения точных результатов необходимо проводить большое количество параллельных измерений.

В данной работе предлагается альтернативный хроматографическим методам слежения за ходом ферментативной реакции подход с применением ³¹P-ЯМР-спектрометрии.

Материалы и методы. В качестве продуцента ФЛД использовали отобранный нами ранее штамм Streptomyces netropsis БИМ В-235 (далее Str. netropsis). Культивирование стрептомицета и получение сухого ферментного препарата осуществляли, как указано в работе [9].

Ферментативный синтез ФС проводили в двухфазной водно-органической реакционной смеси (60 об.% хлороформа и 40 об.% водной фазы). Реакционную смесь объемом 10 мл, содержащую 150 мМ L-серин, 30 мМ ФХ, 0,2 М натрий-ацетатный буфер (рН 6,0), 0,1 М CaCl₂ и 4 мг сухого ферментного препарата, инкубировали при 37^оС и постоянном перемешивании. За ходом реакции следили, используя ТСХ в системе растворителей хлороформ: метанол: 25%-ный водный аммиак (7:4:1 по объему). Вещества обнаруживали, используя специфический реагент на фосфолипиды [10] и 0,25% раствор нингидрина в ацетоне.

Для исследования динамики изменения фосфолипидного состава реакционной смеси отбирали пробы, содержащие 15–20 мг суммарных фосфолипидов. После разделения водной и хлороформной фаз путем центрифугирования (1 мин при 3000 g), органическую фазу аккуратно отбирали с помощью микропипетки и упаривали на роторном испарителе. К образовавшейся пленке фосфолипидов добавляли раствор детергента CHAPS в дейтерированной воде (100 мг/мл), встряхивали до образования прозрачного мицеллярного раствора. ³¹P-ЯМР-спектры регистрировали на приборе Avance 500 («Bruker», Германия) при частоте 272 МГц.

Результаты и обсуждение.

В отличие от описанных ранее приёмов анализа фосфолипидного состава с помощью ³¹P-ЯМР-спектрометрии в данной работе в качестве детергента для солюбилизации фосфолипидов в воде использован цвиттер-ионный 3-[(3-холамидопропил)-диметиламино]-1-пропансульфонат (CHAPS), ранее предложенный для мониторинга ферментативного превращения ФХ в фосфатидилглицерин [11]. Замена используемого в других работах анионного холата натрия (см. обзор [12] и цитируемые в нем статьи) на детергент CHAPS избавляет от необходимости контролировать pH образца, а разрешение сигналов в спектре не зависит от присутствия ионов двухвалентных металлов, в частности Са⁺², являющегося кофактором ФЛД. Пример ³¹P-ЯМР-спектра смеси фосфолипидов из соевых бобов (азолектина) в мицеллах из CHAPS представлен на рис. 1.

Рис. 1. ³¹P-ЯМР-спектр смеси фосфолипидов из соевых бобов

ТФФ – трифенилфосфин; ФХ – фосфатидилхолин; ФИ – фосфатидилинозит; ЛФХ – лизофосфатидилхолин; ФС – фосфатидилсерин; ФЭ – фосфатидилэтаноламин; ЛФЭ – лизофосфатидилэтаноламин; ФГ – фосфатидилглицерин; ФК – фосфатидная кислота

В качестве внутреннего стандарта при регистрации спектра использован раствор трифенилфосфина в дейтерохлороформе, запаянный в капилляр. Сигнал ядер фосфора в трифенилфосфине находится в значительно более сильном поле по сравнению с фосфолипидами и не перекрывается ни с одним из них (рис.1). В большинстве работ для этой цели применяется фосфорная кислота (см. обзор [12] и цитируемые в нем статьи), которая добавляется непосредственно в образец, изменяя при этом pH(D) среды и, как следствие, структуру мицелл. Более того, сигнал фосфорной кислоты находится в области химических сдвигов фосфолипидов и может перекрываться с сигналами некоторых из них.

Ферментативный синтез ФС осуществляли в двухфазной системе хлороформ-вода, используя ФХ из соевых бобов в качестве донора фосфатидильного остатка и L-серин в качестве акцептора. Из реакционной смеси отбирали пробы объемом 1 мл через 10 мин, 30 мин, 1 ч и 2 ч после начала реакции. Результаты ³¹P-ЯМР-спектрометрического анализа содержания фосфолипидов в хлороформной фазе представлены на рис. 2.

Рис. 2. Динамика изменения фосфолипидного состава реакционной смеси при синтезе ФС с помощью ФЛД

Химический сдвиг ФХ в спектрах ³¹Р-ЯМР реакционной смеси принят за нуль.

Как видно из рисунка, в реакционной смеси происходит накопление ФС (до 44% от общего количества фосфолипидов), в меньшем количестве – ФК (до 24%), а также неизвестного фосфолипида (до 16%). Количество ФХ уменьшается в ходе реакции. По данным интегральной интенсивности сигналов ФХ, ФС и ФК в спектрах ³¹Р-ЯМР построен график, отражающий динамику накопления продуктов реакции и убыли ФХ в реакционной смеси. Как следует из графика, накопление ФС практически заканчивается уже через 45 мин после начала реакции. Рассчитанная нами активность ФЛД в синтезе ФС составила около 1540 ед/мг сухого ферментного препарата.

Результаты проведенных исследований дают основание утверждать, что метод ³¹P-ЯМР-спектроскопии может быть успешно использован для исследования кинетики реакции биокаталитического синтеза ФС из ФХ и L-серина. Обнаруженное в результате применения этого метода неидентифицированное фосфорсодержащее соединение, содержание которого растет в ходе ферментативной реакции, является предметом наших дальнейших исследований.

Литература:

1. Damnjanovic J., Iwasaki Y. Phospholipase D as a catalyst: application in phospholipid synthesis, molecular structure and protein engineering // J. Biosci. Bioeng. 2013. Vol. 116, № 3. P. 271–280.

2. Hellhammer J., Fries E., Buss C. et al. Effects of soy lecithin phosphatidic acid and phosphatidylserine complex (PAS) on the endocrine and psychological responses to mental stress // Stress. 2004. Vol. 7, № 2. P. 119–126.

3. Jager R., Purpura M., Geiss K.R. et al. The effect of phosphatidylserine on golf performance // J. Int. Soc. Sports Nutr. 2007. Vol. 4, № 1. P. 23–27.

4. Xu C., Zheng Z., Fang L. et al. Phosphatidylserine enhances osteogenic differentiation in human mesenchymal stem cells via ERK signal pathways // Mat. Sci. Eng. C. Mater Biol. Appl. 2013. Vol. 33, № 3. P. 1783–1788.

5. Gilchrest B. Skin aging and photoaging: an overview // J. Am. Acad. Dermatol. 1989. Vol. 21. P. 610–613.

6. Varani J., Warner R.L., Gharaee-Kermani M. et al. Vitamin A antagonizes decreased cell growth and elevated collagen-degrading matrix metalloproteinases and stimulates collagen accumulation in naturally aged human skin // J. Invest. Dermatol. 2000. Vol. 114, № 3. P. 480–486.

7. Tietjen G.T., Gong Z., Chen C.H. et al. Molecular mechanism for differential recognition of membrane phosphatidylserine by the immune regulatory receptor Tim4 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. Vol. 111, N 15. P. 1463–1472.

8. Naresh N.K., Xu Y., Klibanov A.L. et al. Monocyte and/or macrophage infiltration of heart after myocardial infarction: MR imaging by using T1-shortening liposomes // Radiol. 2012. Vol. 264, № 2. P. 428–435.

9. Birichevskaya L.L., Titovich O.I., Kisel M.A., Zinchenko A.I. Application of Streptomyces netropsis phospholipase D for synthesis of phosphatidylserine // Biotechnology, Biodegradation, Water and Foodstuffs / Eds. G.E. Zaikov, L.P. Krylova. New York: Nova Science Publishers, Inc., 2009. Р. 65–71.

10. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid analysis // J. Cromatogr. 1975. Vol. 114, №1. Р. 129-141.

11. Василькевич А.И., Плющевская П.А., Кисель М.А. Новый подход к анализу фосфолипидных смесей методом ³¹Р-ЯМР спектроскопии // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: сб. статей междунар. науч. конф. Минск 17–20 июня 2014, в 2 т. Мн., 2014. Т.1. С.194–196.

12. Schiller J., Muller M., Fuchs B. et al. ³¹P NMR Spectroscopy of Phospholipids: From Micelles to Membranes. Curr. Anal. Chem. 2013. Vol. 3, №4. P. 283–301.