Береснев А.И.¹, Огнева Е.Н.², Ерошевская Л.А.¹, Квач С.В.¹,

Киселев П.А.², Зинченко А.И.¹

¹Институт микробиологии НАН Беларуси, г. Минск

²Институт биоорганической химии НАН Беларуси, г. Минск

Ферментативный Синтез и цитостатическая

активность кинетинрибозида

Кинетин представляет собой N⁶-модифицированный пурин (N⁶-фурфуриладенин), который был обнаружен как продукт деградации ДНК молок сельди, способный стимулировать деление растительных клеток [1]. Долгое время кинетин считался неприродным (синтетическим) соединением, пока он не был обнаружен в ДНК человека и растений [2]. Недавно кинетин и его рибозилированное производное ‒ кинетинрибозид идентифицировали в млечном соке кокосового ореха (кокосовое молоко) [3, 4]. Кинетин влияет на рост листьев и созревание семян в процессе развития растений (что характерно для фитогормонов цитокининовой природы) и проявляет ряд важных биологических активностей [5].

Кинетинрибозид проявляет мощную антипролиферативную активность против клеточных линий различных видов рака человека, в частности: лейкемии, меланомы, гепатомы, груди, поджелудочной железы и толстой кишки [6‒8]. Этот нуклеозид также проявляет цитотоксический эффект в культуре клеток меланомы [9] и лейкемии [10] мышей. Кроме того, было продемонстрировано, что кинетинрибозид активен против растительных опухолей [9].

Считается, что цитотоксические эффекты кинетинрибозида обусловлены его способностью вызывать быстрое истощение АТФ, приводя к генотоксическому стрессу, который активирует гены р21, CDKN1A и другие гены, ответственные за стресс [8]. При этом гибель клеток происходит по классическому (с участием митохондрий) апоптозному пути. Следует отметить, что кинетинрибозид ингибирует рост не только раковых клеток человека, но и нормальных клеток, и этот эффект сильно зависит от типа клеток. Однако нормальные клетки менее чувствительны к кинетинрибозиду, чем малигнизированные аналоги.

В последние годы кинетинрибозид изучается в качестве терапевтического агента для терапии множественной миеломы [11], острого миелобластного лейкоза [12] и рака прямой кишки [13]. Таким образом, кинетинрибозид играет важную роль при индукции клеточной гибели у клеток различных типов опухолей и может рассматриваться в качестве перспективного кандидата на статус противоопухолевого средства.

Цель настоящего исследования состояла в синтезе кинетинрибозида и проверке его цитостатического действия на культуру опухолевой ткани человека.

Анализ цитотоксичности кинетинрибозида проводили с помощью МТТ-теста по методике, описанной в [14] с небольшими модификациями. Монослойную клеточную культуру HeLa культивировали в среде RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 4 мМ L-глютамин, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37^оС во влажной атмосфере с 5% СО₂. Клеточная культура поддерживалась на стадии логарифмического роста путем рутинного субкультивирования трижды в неделю. В каждую лунку 96-луночного планшета вносили 5000 клеток и инкубировали 24 ч при 37^оС в темноте во влажной атмосфере c 5% СО₂ для адгезии клеток на дне лунки. Далее добавляли кинетинрибозид в концентрации от 1 мкM до 100 мкМ, растворенный в ДМСО (< 0,1%). После 72 ч инкубации при 37^оС в темноте во влажной атмосфере c 5% СО₂ в каждую лунку планшета с клеточной культурой вносили 20 мкл раствора МТТ (5 г/л) и инкубировали на протяжении 4 ч при 37^оС в темноте во влажной атмосфере c 5% СО₂. По окончании инкубации супернатант осторожно удаляли, а в каждую лунку добавляли по 200 мкл ДМСО. Осадок ресуспендировали и инкубировали планшет 15 мин в темноте при комнатной температуре. Показания оптической плотности считывали при длине волны 570 нм на планшетном ридере АИФ-М/340 производства РУП «Витязь» (Беларусь).

Для синтеза кинетинрибозида бариевую соль α-D-рибозо-1-фосфата (донор рибозного остатка) инкубировали в Трис-HCl-буфере (рН 7,5) с эквимолярным количеством кинетина (акцептор рибозного остатка) и рекомбинантной бактериальной пуриннуклеозидфосфорилазой. При этом под действием фермента происходило замещение фосфата в молекуле α-D-рибозо-1-фосфата на кинетин с образованием кинетинрибозида.

При хроматографировании на тонкослойных пластинках "Silufol-UV₂₅₄" фирмы "Serva" (Германия) в системе растворителей: хлороформ–этанол в соотношении 4:1 (об/об), подвижность целевого продукта совпадала с Rf контрольного препарата кинетинрибозида фирмы «Sigma» (США).

УФ-спектр: (рН 7), l_макс нм (e): 268 (19000); (рН 1), l_макс нм (e): 267 (18500); (рН 13), l_макс нм (e): 269 (19100).

Существенное отличие такого технического решения от известных способов получения кинетинрибозида из кинетина и донора рибозного остатка (см., например, [15] состоит в том, что в реакционную смесь донор вносится в виде бариевой соли этого органического фосфата. При этом фосфат, под действием фермента вытесняемый кинетином из α-D-рибозо-1-фосфата, выпадает в осадок в виде водонерастворимой бариевой соли. Это удаление из раствора неорганического фосфата (который требуется пуриннуклеозидфосфорилазе для фосфоролиза нуклеозидов) делает невозможным обратный процесс − фосфоролиз целевого продукта. Таким образом, реакция синтеза целевого продукта становится необратимой, что в результате приводит к практически 100%-ной трансформации исходного кинетина в кинетинрибозид.

Следует подчеркнуть, что процедура выделения целевого продукта из конечной реакционной смеси в предлагаемом техническом решении резко упрощается, поскольку из продуктов реакции в конечном растворе находится практически только кинетинрибозид, в отличие от реакционной смеси, получаемой согласно способу [15], где кроме целевого продукта присутствуют остатки непрореагировавших исходных субстратов, неорганический фосфат, а также α-D-рибозо-1-фосфат (промежуточный продукт) и гуанин (побочный продукт).

Антипролиферативную активность кинетинрибозида по отношению к клеточной линии аденокарциномы шейки матки (HeLa) оценивали с помощью МТТ-теста. Данный метод основан на способности митохондриальных ферментов живых клеток восстанавливать водорастворимую тетразолиевую соль МТТ (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) до формазана, который кристаллизуется внутри клетки. Только живые клетки способны восстанавливать желтый МТТ-субстрат в темно-синий формазан. Число жизнеспособных клеток прямо пропорционально количеству восстанов-ленного формазана, которое можно определить спектрофотометрически после его растворения в органическом растворителе.

Зависимость, характеризующая антипролиферативную активность полученного кинетинрибозида, показана на рис. 1.

Рис. 1 – Ингибирующее действие различных концентраций кинетин- рибозида на рост клеточной линии аденокарциномы шейки матки HeLa

Из рис. 1 видно, что кинетинрибозид оказывает достоверное антипролиферативное действие на клетки HeLa. Концентрация кинетинрибозида, которая вызывает 50% гибель клеток (LC₅₀), составляет 24,2 мкМ, что несколько превышает показатель (5 мкМ), полученный ранее [10].

Литература:

1. Miller C.O., Skoog F., Von Saltza M.H., Strong F.M. Kinetin: a cell division factor from deoxyribonucleic acid // J. Am. Chem. Soc. 1955. Vol. 77. P. 1392–1393.

2. Barciszewski J., Siboska G.E., Pedersen B.O. et al. Evidence for the presence of kinetin in DNA and cell extracts // FEBS Lett. 1996. Vol. 393. P. 197–200.

3. Ge L., Yong J.W.H., Goh N.K. et al. Identification of kinetin and kinetin riboside in coconut (Cocos nucifera L.) water using a combined approach of liquid chromatographytandem mass spectrometry, high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis // J. Chromatogr. B. 2005. Vol. 829. P. 26–34.

4. Yong J.W.H., Ge L., Ng Y.F., Tan S.N. The chemical composition and biological properties of coconut (Cocos nucifera L.) water // Molecules. 2009. Vol. 14. P. 5144–5164.

5. Barciszewski J., Massino F., Clark B.F.C. Kinetin: a multiactive molecule // Int. J. Biol. Macromol. 2007. Vol. 40. P. 182–192.

6. Orr M.F., McSwain B. The effect of kinetin, kinetin ribofuranoside and gibberellic acid upon cultures of skin and mammary carcinoma and cystic disease // Cancer Res. 1960. Vol. 20. P. 1362–1364.

7. Cheong J., Goh D., Yong J.W.H. et al. Inhibitory effect of kinetin riboside in human heptamoa, HepG2 // Mol. BioSyst. 2009. Vol. 5. P. 91–98.

8. Cabello C.M.; Bair W.B., Ley S. et al. The experimental chemotherapeutic N 6-furfuryladenosine (kinetin-riboside) induces rapid ATP depletion, genotoxic stress, and CDKN1A (p21) upregulation in human cancer cell lines // Biochem. Pharmacol. 2009. Vol. 77. P. 1125–1138.

9. Griffaut B., Bos R., Maurizis J.C. et al. Cytotoxic effects of kinetin riboside on mouse, human and plant tumour cells // Int. J. Biol. Macromol. 2004. Vol. 34. P. 271–275.

10. Choi B.H.; Kim W.; Wang Q.C. et al. Kinetin riboside preferentially induces apoptosis by modulating Bcl-2 family proteins and caspase-3 in cancer cells // Cancer Lett. 2008. Vol. 261. P. 37–45.

11. Tiedemann R.E., Mao X., Shi C.X. et al. Identification of kinetin riboside as a repressor of CCND1 and CCND2 with preclinical antimyeloma activity // J. Clin. Invest. 2008. Vol. 118. P. 1750–1764.

12. McDermott S.P., Eppert K., Notta F. et al. A small molecule screening strategy with validation on human leukemia stem cells uncovers the therapeutic efficacy of kinetin riboside // Blood. 2012. Vol. 119, N 5. P. 1200−1207.

13. Rajabi M., Gorincioi E., Santaniello E. Antiproliferative activity of kinetin riboside on HCT-15 colon cancer cell line // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids. 2012. Vol. 31, N 6. P. 474–481.

14. Shim H.Y., Park J.H., Paik H.D. et al. Acacetin-induced apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells involves caspase cascade, mitochondria-mediated death signaling and SAPK/JNK1/2-c-Jun activation // Mol. Cells. 2007. Vol. 24, N 1. P. 95–104.

15. Takeda Chem. Industries Ltd. / Patent N 1063951 GB; 1967.