В.В. Новицкий, И.О. Наследникова, И.Д. Евтушенко, К.С. Кублинский, В.Н. Ткачев, Н.С. Меньшикова, Е.Б. Ильяди, А.С Юрченко

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российский Федерации, Томск, Россия

Полиморфизм гена интерферона-гамма при генитальном эндометриозе

Введение. Генитальный эндометриоз остается одним из самых распространенных гинекологических заболеваний, при котором за пределами полости матки происходит доброкачественное разрастание ткани, по морфологическим и функциональным свойствам подобной эндометрию[1, 2]. В патогенезе заболевания важная роль принадлежит нарушениям иммунного гомеостаза, в том числе и генетически обусловленным, предрасполагающим к определенному ответу иммунной системы на формирование эндометриоидных гетеротопий, их инвазию и распространение. В последние годы большое внимание уделяется изучению роли цитокинов в механизмах формирования эндометриоидных очагов [3].  В связи с этим целью настоящего исследования явился анализ распределения аллельных вариантов гена интерферона-гамма (IFNG), а также поиск ассоциации с уровнем продукции соответствующего цитокина (IFN-γ) в патогенезе генитального эндометриоза.

Материал и методы исследования. В исследовании приняли участие 170 пациенток репродуктивного возраста от 19 до 43 лет (средний возраст 30,6±1,2 года), которые были госпитализированы в гинекологическую клинику ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России в 2010-2011 гг. для выполнения лечебно-диагностической и оперативной лапароскопии и гистероскопии. Показанием к оперативному вмешательству явилось бесплодие. Основную группу составили 102 пациентки с эндометриозом. Диагноз эндометриоза был поставлен в результате осмотра брюшины и органов малого таза на наличие эндометриоидных очагов в ходе эндоскопических методов исследования, с последующим гистологическим подтверждением. Группа сравнения была сформирована из 68 пациенток с бесплодием различной этиологии, которым была выполнена диагностическая лапароскопия и исключен генитальный эндометриоз. Лапароскопию и гистероскопию выполняли по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «Karl Storz» (Германия).

У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор и использование крови для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях у всех пациенток утром в день операции. Стабилизированные образцы крови хранили при –70°С до момента исследования. Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия). С использованием аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) был исследован полиморфный вариант +874A/T гена IFNG, локализованый в промоторном участке соответствующего гена. Амплификацию осуществляли согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «АмплиСенс-200-1» («ИнтерЛабСервис», Россия), в пробирках типа «Эппендорф» путём ПЦР, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе при использовании амплификатора «Терцик МС2» («ДНК-технология», Россия). Общая реакционная смесь для аплификации объёмом 25 мкл содержала: «нижнюю» смесь, состоящую из смеси праймеров (Common и F или Common и R) («Синтол», Россия) и смеси дезоксинуклеотид-трифосфатов, 2мМ (dNTP-mix) в равных частях в отдельных пробирках на каждую пару праймеров; «верхнюю» смесь, включающую 10 мкл 5-х ПЦР-буфера, 2,5 мкл 50мМ MgSO4, 6,5 мкл Н2О и 1,0 мкл Tag-полимеразы (из расчёта на одну пробирку). Раскапывали в микропробирки для ПЦР по 5 мкл «нижней» смеси и по 10 мкл «верхней» смеси. Сверху капали по 1 капле масла для ПЦР. На масло вносили по 10 мкл исследуемой ДНК. Программа амплификации включала в себя предварительную денатурацию при 96°С в течение 1 мин, с последующими 10 циклами, каждый из которых состоял из денатурации при 96°С (15 секунд), отжига при специфической для каждой пары праймеров температуре (50 секунд), элонгации цепи при 72°С (40 секунд). Затем 20 циклов, состоящих из денатурации при 96°С (10 секунд), отжиг при 60°С (50 секунд) и элонгации при 72°С (40 секунд). Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 1 мин. После этого 8 мкл амплификата разделяли в 2% агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида, для последующей визуализации в ультрафиолетовом свете, подтверждающей наличие продукта амплификации. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим», Россия).

Содержание IFN-γ в сыворотке крови и перитонеальной жидкости оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией, прилагаемой производителем тест-систем («Cytimmune», США). Оптическую плотность растворов регистрировали на микропланшетном фотометре Multiskan EX («ThermoLabSystems», Финляндия). Концентрацию цитокинов рассчитывали по калибровочной кривой.

Для проверки нормальности распределения показателей использовали критерий Колмогорова-Смирнова; равенство выборочных средних проверяли по t-критерию Стъюдента (в случае нормального распределения) и U-критерию Манна-Уитни (при отклонении распределения от нормального). Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах женщин, используя критерий χ2 с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации разных генотипов и аллелей с заболеванием судили по величине отношения шансов (odds ratio (OR)) с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI).

Результаты исследования и их обсуждение. Накоплен определенный материал о роли цитокинов, контролирующих процессы апоптоза, пролиферации и дифференцировки, а также обеспечивающих благоприятные условия для внедрения и развития жизнеспособных элементов эндометрия. В частности, данные относительно продукции IFN-γ при генитальном эндометриозе весьма противоречивы: по мнению одних исследователей содержание данного цитокина и в сыворотке крови, и в перитонеальной жидкости было повышено, по результатам других ученых, напротив, было значительно снижено [1, 2, 3]. При исследовании содержания IFN-γ с помощью иммуноферментного анализа нами было установлено, что у пациенток с генитальным эндометриозом уровень изучаемого цитокина в сыворотке крови (31,74 пг/мл) и перитонеальной жидкости (48,12 пг/мл) был статистически значимо ниже, чем у женщин без данной патологии (169,07 пг/мл, p<0,05 и 207,17 пг/мл, p<0,005 соответственно).

IFN-γ секретируется CD4+ T-лимфоцитами, CD8+ T-лимфоцитами и активированными натуральными киллерами. Многообразие  биологических эффектов IFN-γ, его ключевая роль как медиатора межклеточных взаимодействий в поддержании гомеостаза предполагает его участие во многих патологических процессах, в том числе и в иммунопатогенезе эндометриоза. IFN-γ является самым сильным индуктором макрофагов, в результате чего возрастает их фагоцитарная и микробицидная активность, усиливаются мембранные процессы, биосинтез оксида азота и кислородных радикалов, проявляется способность макрофагов секретировать белки системы комплемента и цитокины. Кроме этого, IFN-γ активирует натуральные киллеры, в результате чего усиливается цитолиз клеток-мишеней [3, 4]. Недостаточная продукция IFN-γ ведет к неспособности организма ограничивать пролиферацию и инвазию эктопического эндометрия, и заболевание протекает тяжело, нередко с осложнениями. 

IFN-γ кодируется геном IFNG, локализованным на хромосоме 12q24.1 и содержащим 4 экзона и 3 интрона. Полиморфный сайт +874A/T расположен в первом интроне гена IFNG и также относится к однонуклеотидным заменам. Выявлено, что наличие аллеля +874А в гене IFNG ассоциировано со сниженной экспрессией гена и, следовательно, со снижением продукции этого цитокина клетками иммунной системы [4, 5]. В связи с этим нами была предпринята попытка оценить распределение аллельных вариантов и генотипов полиморфизма +874А/Т гена IFNG у пациенток с эндометриозом. Так среди пациенток с генитальным эндометриозом было выявлено значимое преобладание генотипа АА (54%) над вариантами АТ (18%) и ТТ (28%) полиморфного участка +874А/Т гена IFNG. Кроме того среди пациенток с генитальным эндометриозом частота генотипа АА оказалась достоверно выше, а варианта ТТ, напротив, ниже, чем у женщин без данной патологии(χ2=4,90; р<0,05). Степень риска развития генитального эндометриоза была положительно ассоциирована с гомозиготным вариантом АА (OR=3,94), а также с аллелем А (OR=2,99) полиморфного участка +874А/Т гена IFNG. Аллель Т (OR=0,52) и гомозиготный генотип ТТ (OR=0,37) полиморфизма +874 A/T гена IFN-γ обусловливали протективный эффект в отношении подверженности генитальному эндометриозу.

Суммируя полученные данные, следует отметить, что сниженное содержание IFN-γ в сыворотке крови и перитонеальной жидкости у женщин с генитальным эндометриозом обусловлено носительством генотипа АА и аллеля А полиморфного участка +874А/Т гена IFNG (ассоциированных с низкой продукцией цитокина). Подверженность генитальному эндометриозу также ассоциирована с наличием генотипа АА и аллеля А полиморфизма +874А/Т гена IFNG. 

Литература:

1.     Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы. – М.: Медицина. 2006. – 416 с.

2.     Ищенко А.И., Кудрина Е.А. Эндометриоз: диагностика и лечение. – М.: МИА. 2008. – 176 с.

3.     Harada T., Iwabe T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis // Fertil. Steril. – 2001. – V.76.№1. – Р. 1-10.

4.     Ollier, W.E. Cytokine genes and disease susceptibility / W.E. Ollier // Cytokine. – 2004. – Vol.4-5. – P. 174-178.

5.     Polymorphisms of the human IFNG gene noncoding regions / J.H. Bream, M. Carrington, S. O'Toole et al. // Immunogenetics. – 2000. – №51. – Р. 50-58.