My Article

Существующие на сегодняшний день методы ДНК-анализа позволяют получать точные и достоверные результаты генетических исследований. Использование ДНК-маркеров дает возможность провести анализ изменчивости и разнообразия видов, а также сделать вывод о генетическом разнообразии. Существует множество методов, которое являются затратными по времени и цене исследований, при этом не всегда обеспечиваются эффективность проводимого анализа. Метод ДНК-маркеров показывает хорошие результаты, и доказывают свою эффективность для решения такого рода задач.

Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет увеличивать малые концентрации определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале. При этом, один из ресурсоемких и трудоемких этапов формирования первичных данных, является анализ цифровых изображений результатов химической реакции [1]. Использование таких коммерческих программ как RAD-BioMed, FastPCR, Sigma позволяет решить ряд задач, возникающие при анализе изображений гелей, но как показывает практика ряд задач остается нерешенной [2].

Предлагаемая разработка автоматизированной системы на базе методов распознавания и анализа цифровых изображений гелей, позволит минимизировать трудоемкие операции выполняемых человеком и повысит качество проводимых работ. Разработке необходимых теоретических методов и практических реализаций автоматизированного анализа данных будет посвящена настоящая работа.

Анализ изображения гелей, получаемых в результате электрофореза образцов содержащих продукты ПЦР с использованием праймеров, представляет собой трудно формализуемую задачу.

$D:\!_Kurss\BioGene\Статья РОАИ\Genes 2.0\Clear Image\Gel Doc 2011-07-12 16hr 27min_5_37-54.jpg$

Рис. 1. Изображение электрофореграммы ПЦР-продуктов ДНК
сосны с праймером (CA)₆AGG.

Это связанно не только с большим числом полос выявляемых при электрофорезе, но и с рядом проблем возникающих в результате не возможности стандартизации всех условий проведения электрофореза. На рис.1. представлено изображение продуктов ЦПР.

Так статистические характеристики наблюдаемых изображений (рис .1), обосновывают принятие их следующей математической модели:

(1)

где – средний уровень яркости, – центрированный симметричный нормальный шумовой процесс с СКО и – функция распределения освещенности по площади кадра.

Характерная периодизация вдоль горизонтали, областей с праймерами, обосновывает получение оценки вдоль вертикали кадра для каждого столбца среднего уровня яркости и дисперсии. Оценка среднего уровня яркости подтверждает принятую модель изображения (1) с мультипликативной составляющей. Неравномерность освещения в этом случае можно устранить, используя полином второй степени [3]. Для дальнейшей обработки воспользуемся оценкой дисперсии яркости, поскольку он не содержит характерных мультипликативных искажений.

Для биологического анализа необходимо обработать изображение (рис.1.) и определить точные пространственные положения объектов, являющихся продуктами ПЦР. Данный тип электрофореграммы был получен с помощью оборудования и программного комплекса RAD-BioMed. Анализ изображений показывает, что праймеры и продукты ПЦР, расположены в вертикальных пространственных областях, которые не пересекаются. Такое расположение дает возможность, синтезировать алгоритм локализации границ этих областей.

Детальный анализ оценки дисперсий вдоль вертикали кадра, показывает, что пара из светлых вертикальных просветов, образует определенную форму сигнала. На рис.2,а представлены графики таких сигналов. Границы слева и справа характеризуются, резким вертикальным фронтом, а центральная часть образует явно выраженную параболу.


а	б
Рис.2. а – графики пары светлых вертикальных просветов; б – графики усредненной и интерполирующей функции

Усредним, статистически отобранные, сигналы (рис.2,б) – , а также получим оценки, оптимальных регрессионных моделей (рис.2,б). Критерием оптимальности служит комплексное значение, которое состоит среднеквадратической ошибки и коэффициента корреляции. Анализ из 50 изображений показывает, что наилучшая регрессионная модель, которая может описать данный тип сигнала – это полином четвертой степени [3]:

, (2)

где ,,,,. На рис.2,б представлены эмпирические данные и регрессионная модель (2) с заданными параметрами.

Функция (2) может рассматриваться, как импульсная характеристика согласованного фильтра для обнаружения вертикальных координат центров областей, где расположены праймеры.

(3)

Согласованный фильтр рассчитан так, чтобы отношение энергии сигнала к энергии шума достигало максимума в точке, которая и будет определять целевое значение. Данный тип фильтрации обеспечивает наилучшее отношение сигнал/шум и гарантирует получение точных оценок [4,5]. Данный подход используется для обнаружения вертикальных и горизонтальных координат областей, где сосредоточены интересующие нас праймеры.

Рис. 3. Графическое представление обнаружения пространственных координат праймеров.

На рис.3 представлено изображение выделенного участка с локализованными и маркированными праймерами. Разработанный программный комплекс позволяет проводить анализ цифровых изображений гелей ПЦР, при этом минимизирует трудоемкие операции выполняемых человеком и повысит качество проводимых работ. Синтезированный алгоритм имеют свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2012619172 «BioImage Geles PCR Analysis» от 11.10.2012 года. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, проект 13-01-00427а.

Список литературы

1. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Higuchi R. // Science. 1988. V.239. N.2. Р.487.

2. П.С. Новиков, О.В. Шейкина, Т.Н. Милютина Изменчивость плюсовых деревьев сосны обыкновенной на архиве клонов по ISSR-маркерам // Вестник МарГТУ. Радиотехнические и инфокоммуникационные системы. – Йошкар-Ола: МарГТУ– №.3, 2011. – С.82-87.

3. Самарский, А. А. Численные методы / А. А. Самарский, А. В. Гулин – М.:Наука, 1989. – 432 с.

4. Тихонов, В.И. Оптимальный прием сигналов / В.И. Тихонов – М.: Радио и связь, 1983. – 320 с.

5. Ипатов, Ю. А. Обработка и автоматический анализ изображений наземной лесной таксации / Ю. А. Ипатов, А. В. Кревецкий – LAP LAMBERT Academic Publishing, 2013. – 184 с.

6. Прэтт У. Цифровая обработка изображений: в 2 кн. М.: Мир, 1982.– 790 с.