Кургамбаева Г.С., Есенбаева А.Е., Ханнанов Р. А., Тен О.А., Балпанов Д.С. Филиал РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан», КН МОН РК в г. Степногорск, e-mail: ipbncbrk@mail.ru

Выделение азотфиксирующих микроорганизмов из почв Северного Казахстана

Введение

Интерес к возделыванию зерновых и зернобобовых культур на территории Казахстана связан с увеличением количества голов крупного рогатого скота и повышением спроса на бобовые и зернобобовые культуры на внешнем рынке. Перспективными для использования являются бобовые травы (люцерна, клевер, донник, козлятник восточный), а также зернобобовые культуры (нут, горох, чечевица, фасоль, соя).

Азот является необходимым элементом для всех живых организмов. Основным резервуаром азота служит земная атмосфера, однако способностью к биологической фиксации амосферного азота обладают лишь незначительное число микроорганизмов. Процесс связывания азота атмосферы этими микроорганизмами называется биологической азотфиксацией. Многие животные и грибы, растения способны вступать в симбиоз с азотфиксирующими прокариотами [1].

Азотфиксирующие симбиотические бактерии, широко известные как Rhizobium sp., используются в производстве биологических удобрений для бобовых растений. С развитием животноводческой отрасли зернобобовые культуры приобрели высокую значимость в кормлении различных видов животных в качестве источника кормового белка [2-4]. Бактерии рода Rhizobium - строгие аэробы. Среди них различают активные, малоактивные и неактивные культуры. Критерием активности клубеньковых бактерий служит их способность в симбиозе с бобовым растением фиксировать атмосферный азот. Воздействие активных штаммов симбиотических азотфиксирующих бактерий Rhizobium sp. способствует повышению синтеза у растений белковых веществ гормональной природы (ауксинов, гиббереллинов, цитокининов), антибиотических и антифунгальных веществ. [5,6].

В результате возникновения симбиоза растения с азотфиксирующими микроорганизмами бобовые и зернобобовые культуры производят на единице посевной площади больше высококачественного легкоусвояемого белка по сравнению с культурами других семейств.

Различают и другие виды азотфиксирующих микроорганизмов, например активные азотфиксаторы - свободно живущие микроорганизмы, обитающие в почве и водоёмах - спороносная бактерия Clostridium. Активными азотфиксаторами являются и многие виды сине-зелёных водорослей (Nostoc, Апаbaena и др.), некоторые пурпурные серобактерии и зелёные бактерии. Участвуют в фиксации атмосферного азота некоторые виды грибов, дрожжей и спирохет. Азотфиксирующие микроорганизмы имеют очень важное значение в круговороте азота в природе, и в частности, в снабжении доступными формами азота растений, которые не способны усваивать его из воздуха, а получают азот после минерализации белка.

В последние 2-3 десятилетия интерес к биологической азотфиксации значительно возрос. Это связано не только с определяющей ролью этого процесса в азотном балансе биосферы, но и возможностью сокращения объемов применения минерального азота при одновременном снижении энергетических затрат на производство продукции, что весьма актуально в свете современных тенденций биологизации земледелия [7-9].

Препараты на основе клубеньковых бактерий широко используются во многих странах под различными названиями (во Франции - N-germ, в Чехии и Словакии – нитразон, а России – нитрагин, ризоторфин и т.д). Также искусственная инокуляция бобовых культур клубеньковыми бактериями проводится в Болгарии, Польше, США, Канаде, Франции и др.

Материалы и методы исследований

Целью работы являлось выделение штаммов из каштановых почв Северного Казахстана. Для выделения использовали образцы почвы. Из образцов готовили разведения 1:100 (1 г почвы на 100 мл дистиллированной стерильной воды) и перемешивали на шейкере в течение 2 часов. В дальнейшем проводили десятикратные разведения с последующим высевом на чашки Петри с агаризованной средой Эшби. Чашки культивировали при температуре 28 °С в течение 2 суток. Выросшие изолированные колонии отсевали петлей в пробирки на поверхность скошенной плотной среды в тех же условиях.

В процессе работы использовали универсальные, селективные и накопительные питательные среды. Выделение и поддержание выделенных культур осуществляли на агаризованных средах. Для отработки процесса глубинного культивирования использовали жидкие питательные среды (без добавления агара). Ниже приведен состав питательных сред:

Питательная среда с гороховым отваром. Состав (г/л): К₂НPO₄ - 1,0; MgSO₄ - 0,3; сахароза - 10,0; отвар из 100 г зерен гороха – до 1 л. pH 6,8-7,0.

Агаризованная питательная среда Эшби г/л: сахароза - 10; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,2; K₂HPO₄ – 0,2; K₂SO₄ - 0.2; CaCO₃ - 5,0; агар – 20; pH =7,0-7,2.

Для выделения микроорганизмов Rhizobium sp отбирали растения определенного вида (донник, люцерну, клевер, козлятник, горох, сою) с хорошо развитой корневой системой и наличием активных клубеньков. Активность клубеньков при отборе образцов определяли визуально - образование в клубеньках легоглобина придает им красновато-розовую окраску на срезе. Неактивные клубеньки, напротив, имеют коричневую или зеленоватую окраску.

Отобранные образцы (клубеньки) в лабораторных условиях промывали и помещали на поверхность питательной среды в чашке Петри, разрезали стерильным ножом, затем шпателем растирали содержимое клубенька по поверхности питательной среды. Этим же шпателем, без прокаливания, проводили рассев содержимого клубенька еще на 4 чашки Петри последовательно.

Для выделения Rhizobium sp из клубеньков гороха и клевера использовали питательную среду на гороховом отваре, для выделения Agrobacterium tumefaciens – питательную среду Эшби.

Отбор моноизолятов проводили на 3-4 сутки. Колонии отбирали по типичному внешнему виду: на плотных питательных средах в чашках Петри через 36-48 часов роста при 28 (±1)°С образовывались слизистые белесоватые колонии диаметром 2-3 мм. Выделенные изоляты представляют собой мелкие подвижные палочки с закругленными краями, расположенные в мазке хаотично. Моноизоляты отсевали на скошенную питательную среду на гороховом отваре и среду Эшби.

По результатам теста отобраны 10 изолятов, культурально-морфологические свойства которых указаны в таблице 1.

Таблица 1. Культурально-морфологические признаки выделенных изолятов

Номер изолята	Результаты микроскопии
Z-1	Мелкие овальные палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.
Z-2	Мелкие палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.
Z-3	Мелкие палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.
Z-4	Мелкие палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.
Z-5	Мелкие овальные палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.
Z-6	Мелкие овальные палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.
Z-8	Мелкие овальные палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.
Z-9	Мелкие овальные палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.
Z-10	Мелкие овальные палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.
Z-11	Мелкие палочки с закругленными концами, мазке расположенны хаотично, подвижные. Слизистые колонии прозрачного цвета.

В дальнейшем было проведено изучение физиолого-биохимических свойсв выделенных моноизолятов. Результаты физиолого-биохимического анализа выделенных моноизолятов представлены в таблице 2.

Таблица 2- Определение биохимических свойств изолятов способом сбраживания сахаров

Сахара	Азотфиксирующие микроорганизмы
	Z-1	Z-2	Z-3	Z-4	Z-5	Z-6	Z-8	Z-9	Z-10	Z-11
Арабиноза	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Целлобиоза	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Фруктоза	+	-	+	+	+	+	+	+	±	+
Галактоза	+	+	-	+	+	-	+	-	+	+
Лактоза	+	+	±	+	-	+	+	+	+	+
Мальтоза	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Маннит	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Манноза	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Раффиноза	+	+	+	+	-	+	+	+	+	-
Сахароза	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+
Трегалоза	±	+	+	+	±	+	+	±	+	+
Ксилоза	-	+	-	-	-	-	-	-	-	±

По физиолого-биохимическим и культурально-морфологическим признакам изоляты, выделенные из почв идентифицированы как представители вида Agrobacterium tumefaciens - Z-1, Z-2, Z-4, Z-9, Z-11 и Rhizobium pusense Z-3, Z-5, Z-6, Z-8, Z-10 [10-11].

В дальнейшем исследовали генетическое родство выделенных штаммов. С этой целью определяли филогенетическое родство на основе сравнения нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК. С помощью программного приложения MEGA 4.0 были сопоставлены с последовательностями из базы данных BLAST. Филогенетические древа представлены на рисунках 1,2.

Рисунок 1. Филогенетическое дерево изолятов Agrobacterium tumefaciens Z-1, Z-2, Z-4, Z-9, Z-11

Рисунок 2. Филогенетическое дерево изолятов Rhizobium pusense Z-3, Z-5, Z-6, Z-8, Z-10

Согласно результатам сравнительного анализа гена 16S рРНК штаммы Z-1, Z-2, Z-4, Z-9, Z-11 были отнесены к Agrobacterium tumefaciens. Степень его гомологи с референсными последовательностями (AJ 389907) составила 100%. Изоляты Z-3, Z-5, Z-6, Z-8, Z-10 были отнесены к Rhizobium pusense, степень его гомологи с референсными последовательностями (NR 116874), (KF 888659), (AB 969785) составило 99%.

Таким образом, проведенный нами филогенетический анализ, на основе сопоставления последовательностей генов 16S рРНК подтвердил морфолого-биохимическую классификацию выделенных изолятов.

Выводы

Таким образом, в результате проделанной работы отработан метод выделения азотфиксирующих микроорганизмов, идентификацию которых проводили до вида по биохимическим и культурально-морфологическим признакам с подтверждением сопоставления последовательностей генов 16S рРНК. На основе полученных данных изоляты Z-1, Z-2, Z-4, Z-9, Z-11 азотфиксирующих микроорганизмов относящиеся к Agrobacterium tumefaciens. Изоляты Z-3, Z-5, Z-6, Z-8, Z-10 относятся к виду Rhizobium pusense.

Литература:

1. Игнатов В.В. Биологическая фиксация азота и азотфиксаторы // Соросовский образовательный журнал. 1998.

2. Косолапов В.М. Фицев А.И., Гаганов А.П., Мамаев М.В. Горох, люпин, вика, бобы: оценка и использование в кормлении сельскохозяйственных животных. – Москва, 2009.

3. Карагуйшиева Д.К. Свободноживущие азотфиксаторы почв Казахстана / Алма-Ата: Наука, 1972. - 199 с.

4. Мамилов Ш.З. Азотфиксирующие ассоциации с Rhodopseudomonas sp. в затопляемых почвах под рисом. // Повышение плодородия почв рисовых полей. М.: Наука. - 1977. -С. 116-121.

5. Илялетдинов А.Н. Микробиологические превращения азотсодержащих соединений в почве / Алма-Ата, Наука, 1976.-281 с.

6. Fisher Hans-Martin. Genetic Regulation of Nitrogen fixation in Rhizobia// Microbioligical reviews.-September, 1994. –Р. 352-386.

7. V.V. Deshmukh, S.S. Mane, R.M. Gade, R.W. Ingle, M.S. Joshi. Biochemical studies of Bradyrhizobium japonicum isolates // American international Journal of Research in Formal, Applied and Natural Sciences. – 2013. - Vol. - 4(1). P. 53-57.

8. S.M. Nour, M.P. Fernandez, Ph. Normand, J-C. Cleyet-Marel. Rhizobium ciceri sp. Nov., Consisting of strains that nodulate Chickpeas (Cicer arithenium L.) // International Journal of Systematic Bacteriology.- 1994.- Vol.- 44. No.- 3. P. 511-522.

9. M.J. Sadowsky, H.H. Keyser, B.B. Bohlool. Biochemical characterization of fast- and slow-growing rhizobia that nodulate soybeans // International Journal of Systematic Bacteriology.- 1983.- Vol.- 33. No.- 4. P. 716-722.

10. V.K. Deshwal, A. Chaubey. Isolation and Characterization of Rhizobium leguminosarum from Root nodule of Pisum sativum L. // Journal of Academia and Industrial Research (JAIR). – 2014. – Vol. 2. – Р. 464-467.

11. F. Shahzad, M. Shafee, F. Abbas, S. Babar, M.M. Tariq, Z. Ahmad. Isolation and biochemical characterization of Rhizobium meliloti from root nodules Alfalfa (Medico sativa) // The Journal of Animal and Plant Sciences. – 2012. Vol. - 22(2). P. 522-524.