Получение  гаплоидных растений белокачанной капусты (Brassica  oleracea L.) в условиях in vitro

Киракосян Р.Н., д.б.н. Калашникова Е.А.

Российский государственный аграрный университет-МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва, Россия, e-mail: mia41291@mail.ru

Получение гаплоидных растений белокачанной капусты (Brassica oleracea L.) в условиях in vitro

Важным направлением в современной селекции является создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессовым факторам среды при сохранении и повышении их продуктивности и качества. Рациональное сочетание методов классической селекции с биотехнологическими методами позволяет решать поставленные задачи в более короткий срок.

Метод культуры изолированных пыльников и микроспор (андрогенез) – один из перспективных способов получения гаплоидных растений. Подбор оптимальных условий культивирования, обеспечивающих дифференцировку эмбриоидов из репродуктивных органов (микроспоры и семяпочки) и сравнение этого процесса с процессом формирования соматических и зиготических зародышей является предметом биохимических и морфологических исследований, и целью опытов по изучению молекулярных механизмов, специфичных для эмбриогенеза. Андрогенез зависит от ряда взаимосвязанных факторов (генетических, физиологических, факторов внешней среды (минеральномого и гормонального состава питательной среды), условий культивирования), каждый из которых оказывает свое влияние на морфогенетические процессы при культивировании изолированных пыльников и микроспор in vitro. Результаты исследований ряда авторов показали, что до сих пор эмбриогенез в культуре пыльников in vitro различных видов Brassica происходит спонтанно и имеет низкую частоту выхода гаплоидных растений (1-4%), более того предлагаемые технологии трудно воспроизводимы и недостаточно изучены на каждом этапе андрогенеза. Помимо этого, технология получения растений-регенерантов различных видов Brassica из изолированных семяпочек (процесс гиногенеза) из известной литературы не отработана.

Целью наших исследований являлась разработка регламента получения растений-регенерантов белокочанной капусты (B. oleracea L.) из репродуктивных органов путем прямого эмбриогенеза.

Работу проводили на линиях и гибридах F₁представителей рода Brassica- белокочанной капусте (B. oleracea L.): гибрид F₁ Юбилей, линии ЭТ1 и АМФ 3Л. Растения – доноры выращивали в теплице на Селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева в течение года. Объектом исследования служили изолированные бутоны, микроспоры, завязи и семяпочки.

В работе использовали питательные среды по прописие.рид Клаус, линия Мурасиге и Скуга с добавлением фитогормонов. В качестве веществ с цитокининовой активностью использовали препарат Дропп, БАП, кинетин, 2ip в концентрациях 0,01 - 2,0 мг/л, в качестве веществ ауксинового типа – 2,4-Д, НУК, ИУК в концентрациях 0,5 – 1,5 мг/л. рН среды 5,5-5,8.

В работе нами были оптимизированы этапы получения растений-регенерантов путем прямого эмбриогенеза из микроспор изолированных пыльников (Рис.1). Предложена схема комплексной предобработки соцветий пониженными (+4-6⁰С в течение 2-х суток) и повышенными (+32⁰С в течение 1-х суток) температурами в сочетании с обработкой соцветий нитратом серебра (40 мг/л), обеспечивающая индукцию прямого эмбриогенеза. $G:\DCIM\Camera\IMG_20120404_155204.jpg$ $G:\DCIM\Camera\IMG_20120424_120056.jpg$ $G:\DCIM\Camera\IMG_20120515_154225.jpg$ $G:\DCIM\Camera\IMG_20120515_162236.jpg$

а б в г

Рис. 1. Этапы получения растений-регенерантов путем прямого эмбриогенеза из микроспор изолированных пыльников (гибрид F₁ Юбилей): а – образование адвентивных побегов, б – рост побегов и формирование корневой системы, в – растения перед высадкой в почву, г – растения-регенеранты в почве,

Цитологический анализ растений-регенерантов проводили путем подсчета количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц. Установлено, что количество хлоропластов в клетках устьиц гаплоидного растения составило от 10 до 15 шт., в то время как у исходных донорных растений их было от 35 до 45 шт. (Рис. 2).

$H:\CHUNG\DE TAI CHUNG-KO XOA\ANH THI NGHIEM\NAM 2009\NAM 2009\Thang 10\14102009-xpomocom\DSC08247.JPG$

а б

Рис. 2. Хлоропласты в замыкающих клетках устьиц: а– исходные растения белокочанной капусты, б -растения-регенеранты (F₁Юбилей)

Установлено положительное влияние торфо-дернового субстрата (в соотношении 1:1) на адаптацию растений-регенерантов белокочанной капусты к условиям in vivo (Рис. 3).

$G:\DCIM\Camera\IMG_20120704_082915.jpg$ $G:\DCIM\Camera\IMG_20120704_082518.jpg$

а б

Рис.3. Адаптация растений-регенерантов: а- линии ЭТ1; б- F₁Юбилей

Литература

1. Гурецка, К. Получение гомозиготных линий капусты белокочанной (Brassica oleracea L, var capitata L.) через культуру пыльников - Скерневицы, 1998. – 71с.

2. Жамбакин, К.Ж. Гаплоидная биотехнология растений. - Алматы, 2004.-186 с.

3. Калашникова Е.А. Клеточная инженерия растений: Курс лекций. М.: Изд-во РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева, 2009. – 94 с.

4. Калашникова Е.А.,Чунг Май Дык Теоретические и практические аспекты получения гаплоидных и дигаплоидных растений in vitro различных видов Brassica-LAP: LAMBERT Academic Publishing, 2012, 126 с.

5. Чистякова В.Н. Гаплоиды неполных пшенично-пырейных амфидиплоидов, мягкой пшеницы и ячменя: получение и использование. М. МАКС Пресс, 2000. - 355 с.