Нгуен Тхи Выонг, д.б.н. Калашникова Е.А.

Российский государственный аграрный университет-МСХА имени К.А. Тимирязева, Москва, Россия, e-mail:kalash0407@mail.ru

Клеточная селекция пекинской капусты на устойчивость к серой гнили (Botrytis cinerea)

Пекинская капуста является одной из важнейщих овощных культур в мире. Причем, потребность в этой культуре увеличивается с каждым годом. По содержанию питательных веществ, диетическим свойствам и вкусовым качествам пекинская капуста превосходит все другие виды капусты. Однако, пекинская капуста поражается несколькими грибными заболеваниями, из которых наиболее вредоносной является серая гниль, вызываемая грибом серая плесень (Botrytis cinerea). Таким образом, задача создания растений, устойчивых к серой гнили, представляется актуальной.

Объектом исследования служили семена пекинской капусты двух сортов (Хибинская и Ника F₁) не обладающих устойчивостью к серой гнили.

В первой серии эксперимента оптимизировали условия стерилизации семян с целью получения хорошо растущих стерильных проростков. В качестве стерилизующих препаратов использовали сулему (хлорид ртути) в концентрации 0,1% и «Белизну» в концентрации 1:3. Экспозиция воздействия стерилизующих веществ составило от 5 до 7 мин. Экспериментально установлено, что применение в качестве стерилизующего вещества «Белизну», для стерилизации семян пекинской капусты, не является оптимальным, так как в этом случае получение хорошо растущей стерильной культуры составляет всего 20 - 30 % и этот показатель не зависит от времени стерилизации. При использовании в качестве стерилизующего вещества сулемы было получено от 47% до 56% стерильных проростков, и этот показатель зависел от времени воздействия стерилизующего агента на семена.

Для получения каллусной ткани в качестве первичного экспланта использовали сегменты семядольных листьев, изолированные с 5-дневных стерильных проростков пекинской капусты. Экспланты культивировали на питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей 2,4-Д в концентрации 1.0 мг/л и и БАП 0.5 мг/л. Установлено, что через 5-7 дней с момента культивирования эксплантов в данных условиях, происходило увеличение размера эксплантов по длине и ширине, а затем на 20-й день начинался процесс каллусогенеза. Причем каллусная ткань образовывалась по всей поверхности первичного экспланта (рис.1а). Данная ответная реакция различных эксплантов была характерна для всех исследуемых генотипов.

Для проведения работ по клеточной селекции нами был использован в качестве селектирующего агента культуральный фильтрат гриба Botrytis cinerea, чистую культуру которого выращивали в жидкой питательной среде на качалке со скоростью вращения 100 об/мин. (рис.2 б). Питательная среда при этом изменяла цвет и становилась светло-желтой. Культуральный фильтрат получали путем фильтрования суспензии гриба через фильтровальную бумагу с последующим его автоклавированием.

а б

Рис. 1. Каллусная ткань, полученная из семядольных листьев, изолированных с 5-дневных стерильных проростков пекинской капусты (а), культуральный фильтрат гриба Botrytis cinerea (б)

Для проведения клеточной селекции необходимо оценить фитотоксичность получаемого фильтрата. Для этой цели определяли длительность культивирования КФ патогена в жидкой питательной среде и устанавливали сроки его выращивания (до 40 суток), при которых наблюдается максимальное накопление экзометаболитов гриба в культуральной среде. Оптическую плотность КФ определяли при длине волны спектрофотометра от 300 до 400 нм. Установлено, что при длине вольны 320 нм КФ имеет максимальную оптическую плотность, равную 0,750 ед., поэтому данная длина волны была выбрана нами за основу и применялась в дальнейших экспериментах по определению сроков культивирования патогенна в жидкой питательной среде, с целью получения культурального фильтрата, обладающего максимальной фитотоксичностью. Измерения оптической плотности проводили в динамике и определяли каждые 5 дней (Рис. 2)

Рис. 2 Зависимость оптической плотности КФ от длительности культивирования патогена в питательной среде (при λ =320 нм)

Показано, что начало активного выделения экзометаболитов в питательную среду приходится на 20 сутки с начала культивирования потогена. В этом случае оптическая плотность жидкости составила 0,345 ед. При дальнейшем культивировании гриба наблюдалось значительное повышение оптической плотности культуральной жидкости, которое достигло максимума на 45 день культивирования патогена в среде, и составила 0,750 ед. Однако, начиная с 35 суток, повышение оптической плотности существенно не изменялось. Данные результаты свидетельствуют о том, что после 35 дней выращивания патогена в среде замедляется или останавливается синтез экзометаболитов, который проявляется в сохранении оптической плотности раствора на протяжении последующих дней культивирования патогена in vitro, что говорит о нецелесообразности дальнейшего культивирования гриба в данных условиях.

Для доказательства фитотоксичности КФ, его активность проверяли на семенах (по прорастанию) и на каллусной культуре (по росту). Определяли фитотоксичность КФ в концентрации 0% (контроль), 5%, 15%, 25%, 50%, 75%, 100%.

Исследования показали, что КФ гриба Botrytis cinerea в различных концентрациях оказывает в той или иной степени токсичное действие на прорастание семян пекинской капусты двух изучаемых генотипах (Табл. 1, Рис.3).

Таблица 1

Влияние культурального фильтрата гриба Botrytis Cinerea на биометрические показатели 7-дневных проростков пекинской капусты Хибинская

Вариант	Средняя длина проростков, см	Средняя сумма сырой массы проростков, г	Средняя сумма сухой массы проростков, г	Соотношение сырой массы к сухой массе
Контроль (МС без КФ)	6.53	5.12	0.657	8:1
МС+5%КФ	1.11	0.692	0.075	9:1
МС+15%КФ	0.92	0.481	0.065	7.5:1
МС+25%КФ	0.71	0.463	0.064	7.2:1
МС+50%КФ	0.85	0.552	0.081	6.8:1
МС+75%КФ	0.86	0.493	0.069	7.2:1
100%КФ	1.1	0.426	0.059	7.2:1

а б в

Рис. 3 Влияние различных концентраций КФ гриба на прорастание семян пекинской капусты: а – контроль, б – 5% КФ, в – 75% КФ

Для всех изучаемых генотипов была установлена прямо пропорциональная корреляция, которая проявлялась в следующем: с увеличением концентрации КФ и времени культивирования патогена в суспензионной культуре увеличивалась токсичность полученного КФ.

Полученный культуральный фильтрат патогенна был использован нами в работах по изучению влияния различных концентраций КФ на прирост каллусной ткани изучаемых генотипов пекинской капусты. Установлено, что с увеличением концентрации КФ питательной среде снижается прирост каллусной ткани. Эта закономерность характерна для всех изучаемых генотипов. Исследования морфофизиологических характеристик каллусных культур показали, что ткань состоит из гетерогенных по форме и размерам клеток. Причем, на средах в присутствии селективного фактора клеточные взаимодействия были ярко выражены, что проявлялось в образовании крупных клеточных агрегатов, в отличие от контрольного варианта (Рис.4).

а б

Рис. 4 Каллусные клетки пекинской капусты: а - контроль, б – на среде, содержащей селективный фактор (КФ гриба в концентрации 25%)