Биологические науки / 5. Молекулярная биология

Сорока Т. В.

Національний університет харчових технологій, Україна

Оптимізація процесу визначення креатиніну за допомогою біосенсора на основі рН-чутливих польових транзисторів та креатиніндеімінази в експериментальних зразках

В останні два десятки років відбулось різке збільшення зацікавленості в галузі розробки та використання біосенсорів, що й не дивно, адже вони володіють високою специфічністю та чутливістю, що досягається завдяки використанню біологічних молекул та систем. Біосенсорика – це новітня галузь аналітичної біотехнології, одним з основних напрямків якої є розробка електрохімічних біосенсорів.

Найважливіші характерні ознаки біосенсорів – високі чутливість і селективність, простота використання, швидкість аналізу, широкий діапазон речовин, які можна детектувати. Це визначає можливість, а точніше необхідність, їх застосування практично в усіх галузях людської діяльності, включаючи медицину, фармацевтичну, харчову, біотехнологічну та хімічну промисловість, сільське господарство, охорону довкілля тощо [1].

Послаблення функції нирок та, як наслідок, накопичення токсичних речовин білкового метаболізму в організмі людини є небезпечним для здоров’я. У цьому випадку очищення крові штучною ниркою є ефективною терапією для збереження життя. В процесі діалізу крові вимивається більшість токсичних речовин, однією з яких є креатинін - головний маркер ниркової хвороби. Креатинін – безпорогова речовина, він виділяється із сечею, а рівень його вмісту в сечі та сироватці крові зумовлюється в основному м’язевою масою та видільною здатністю нирок. Тому збільшення рівня креатиніну, як правило, свідчить про зниження функціональної активності нирок. Виведення надлишку креатиніну з організму людини за допомогою штучної нирки потребує постійного контролю концентрації креатиніну, що вимивається, оскільки від цього залежить тривалість процедури діалізу, а відповідно - кількість витрачених матеріалів та час перебування пацієнта за дискомфортних умов гемодіалізу [2].

Для визначення концентрації креатиніну існують такі методи. Це колориметричний метод на основі реакції Яффе. А також високоефективна рідинна хроматографія, іонна хроматографія, міцелярна електрокінетична хроматографія, хроматографічний метод із застосуванням флуоресцентних індикаторів, капілярний електрофорез, капілярний зональний електрофорез, капілярний ізотахофорез, тандемна мас-спектрометрія. Проте всі ці методи досить складні й непридатні для вимірювання концентрацій креатиніну в режимі реального часу.

Тому головною метою цієї роботи є розробка потенціометричного креатинін-чутливого селективного біосенсора для on-line визначення метаболіту креатиніну в діалізній рідині в процесі гемодіалізу [3].

Після проведення дослідів були отримані результати, що біосенсор з креатиніндеіміназою, іммобілізованою протягом 15 і 25 хв, демонстрував швидкий відгук на додавання креатиніну – протягом 1,5-2 хв. Сенсор з імобілізованою креатиніндеіміназою протягом 15 хв характеризувався найбільшою чутливістю. Але було з’ясовано, що цей час іммобілізації недостатній для тривалого фіксування ензиму на поверхні перетворювача – спостерігалося вимивання ферменту протягом шести годин. Збільшення часу іммобілізації ферменту до 25 хв призводило до деякого зменшення чутливості біосенсора (відгуки залишались достатньо великими), але забезпечувало оптимальну “пришивку” ферменту на поверхні перетворювача. Час іммобілізації 35 хв сприяв сильному “зшиванню” молекул креатиніндеімінази, що призводило до дуже низької чутливості біосенсора. Отже, виходячи з аналізу отриманих даних, для подальшої іммобілізації ферменту як оптимальний був обраний час іммобілізації 25 хв.

Калібрувальні криві біосенсорного визначення креатиніну за різного часу іммобілізації ферменту представлені на графіку 1.

Графік 1. Калібрувальні криві визначення концентрації креатиніну, отримані за різного часу іммобілізації в насичених парах ГА: 1) 15 хв; 2) 25 хв; 3) 35 хв.

Подяка

Автор висловлює щиру подяку науковому керівнику – проф. Карпову О.В та науковому консультанту – к. б. н., н. с. Інституту молекулярної біології та генетики Зінченко О.А.

Література

1. Дзядевич С.В., Солдаткін О.П. Наукові та технологічні засади створення мініатюрних електрохімічних біосенсорів. – К.: Наукова думка, 2006. – 255с.

2. Koncki R. Analytical aspects of hemodialysis // Trends in Anal. Chemistry. – 2008. – Vol.27. – №4. – P. 304 – 314

3. Jaffe M. Über den Niederschlag, welchen Pikrinsäure in normalem Harn erzeugt. und über eine neue Reaktion des Kreatinins // Z. Physiol. Chem.-1886.-V.10.-P. 391-400.