Разработка методов очистки рекомбинантных белков Трр17,Трр41 и Трр47 – аналогов антигенов T.pallidum.

Орловская И.В¹., Ткачева И.П.², Киселева Е.К.¹, Мельник А.И.¹

ЧАО НПК «ДиаПроф-Мед», Светлицкого 35,

Киев,Украина

Национальный Университет пищевых технологий, Киев, Украина

Эпидемиологическая ситуация по заболеваемости сифилисом остается крайне напряженной во всем мире. Увеличение числа атипичных и скрытых форм заболевания, а также серорезистентности после лечения сифилиса создает значительные трудности для диагностики инфекции. В этих условиях создание высокочувствительных диагностикумов, позволяющих выявлять заболевание, как на ранних сроках его развития, так и в период скрытого течения остается актуальной проблемой для отечественного здравоохранения.

Рекомбинантные белки, являющиеся аналогами мембранных липопротеинов T.pallidum, широко применяются для изготовления диагностических тест-систем. Цель нашей работы состояла в разработке методов очистки рекомбинантных белков Трр17, Трр41 и Трр47 - аналогов бактериальных антигенов, и дальнейшее их использование при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики IgG к T.pallidum.

Рекомбинантные белки Трр17 и Трр41 и Трр47 нарабатывали в бактериальной экспрессионной системе на основе E.coli. Для их очистки применяли металл-хелатную хроматографию с использованием сорбента Ni²⁺-IDA-toyopearl. Поскольку Трр41 и Трр17 являются растворимыми белками, их очищали непосредственно из бактериальных клеточных лизатов, содержащих 2 М и 4 М мочевины соответственно. Для элюирования белков использовали буферные растворы, содержащие 150 мМ и 300 мМ имидозола соответственно. Выход целевого продукта для белка Трр17 составлял 20%, а для белка Трр41 - 25%. Рекомбинантный белок Трр47 является нерастворимым и накапливается в бактериальной клетке в виде телец включения, поэтому перед хроматографией на Ni²⁺-IDA-toyopearl его растворяли в буфере с 8 М мочевины. Элюцию белка проводили в присутствии 200 мМ имидазола. Так как Трр17 содержит вставку глутатион-S-трансферазы (GST), его дополнительно очищали на GST-Sepharose. Выход целевого продукта составлял 30-35 %.

Очищенные нами рекомбинантные белки Трр17, Трр41 и Трр47 апробированы в составе иммуносорбента при изготовлении иммуноферментных тест-систем, предназначенных для выявления сывороточных IgG к T.pallidum. Для определения диагностической эффективности полученных белков были исследованы 26 сывороток крови здоровых доноров и 16 сывороток крови больных сифилисом. В сыворотках крови здоровых доноров IgG к антигенам T.pallidum не обнаружено. Во всех сыворотках крови больных сифилисом определялись специфические IgG к белку Трр17, в 14 сыворотках - к Трр47 и в 1 сыворотке – к Трр41. Продемонстрировано, что дополнительное включение в состав иммуносорбента рекомбинантных белков Трр41и Трр47 повышает способность тест-системы выявлять IgG к T.pallidum.