Биологические науки / 6. Микробиология

 

Мороз А. С.; к.т.н. Пенчук Ю. М.

Національний університет харчових технологій

ОДЕРЖАННЯ КАЛУСУ CONVALLARIA MAJALIS L. ЯК ОСНОВИ СУСПЕНЗІЙНОЇ КУЛЬТУРИ

 

Методи традиційної біотехнології засновані на культивуванні клітинних культур знаходять все більше розповсюдження в різних областях сучасних досліджень. На відміну від мікроорганізмів, культури клітин вищих організмів являються порівняно новими об'єктами, однак на даний час існує можливість культивування клітин практично всіх тканин і органів людини, тварин і рослин.

Фармацевтичні продукти, ароматичні речовини, прянощі, барвники, біостимулятори, які містяться у вищих рослинах, мають складну хімічну будову. Їх неможливо, або дуже складно синтезувати хімічним шляхом. Ціна деяких таких продуктів на світовому ринку досягає кількох тисяч і, навіть, мільйонів доларів США за 1 кг.

У 50-х роках минулого століття було показано, що під час культивування клітин рослин in vitro можуть накопичуватись біологічно активні речовини (БАР), синтез яких характерний для цього виду рослини. Культури клітин деяких рослинних видів здатні синтезувати різноманітні вторинні метаболіти в концентраціях, близьких і, навіть, більш високих, ніж інтактні рослини. До вторинних метаболітів рослин належать: глікозиди, алкалоїди, ефірні масла, фенольні сполуки, гідроароматичні сполуки, пігменти, мікотоксини [5].

Більшість цих речовин не беруть активну участь у клітинному метаболізмі, а деякі з них навпаки є життєво необхідними для нормального функціонування і розвитку організму. Синтез вторинних метаболітів зазвичай здійснюється після завершення клітинного росту, їх маса порівняно не значна і лише за специфічних умов культивування і мутаційних змін можливо викликати надсинтез вторинних метаболітів. Вони синтезуються у вигляді комбінації кількох різних хімічних сполук [3, 7].

Вирощування клітинних культур в ферментерах подібне до культивування мікроорганізмів. Клітини рослин, на відміну від вирощування рослин у відкритому ґрунті, де вони часто зазнають неконтрольованого впливу біотичних та абіотичних факторів навколишнього середовища можна культивувати в контрольованих умовах на поживному середовищі певного складу, культивування клітин рослин у ферментерах забезпечує постійне одержання свіжого матеріалу упродовж року незалежно від кліматичних і сезонних змін. Наприклад, у стандартних умовах вирощування з одного граму культивованих клітин за шестимісячний термін (звичайний вегетативний період інтактної рослини) можна отримати 100 т клітинної біомаси [4].

Для великомасштабного виробництва характерним є використання суспензійних культур, для якого необхідна промислова апаратура, що відповідає вимогам раціональності конструкції, забезпеченню інтенсивного перемішування середовища та створення делікатних умов культивування. Створення таких умов має дещо проблемний характер, оскільки, незважаючи на те, що для культивування рослинних клітин використовують ті ж технічні засоби, що і для культивування мікроорганізмів, необхідним постає відсутність механічних пошкоджень клітин, які є менш міцними, ніж мікроорганізми. Внутрішня поверхня реактора повинна бути гладкою, а механічна мішалка не повинна створювати сильне турбулентне середовище. Крім того, більшість клітин потребують розвиненої поверхні для свого росту [6].

Суспензійні культури рослин здебільшого складаються з агрегатів клітин різного розміру. Це означає, що клітини на поверхні агрегату та у його центрі не ідентичні, що ускладнює оптимізацію процесу виробництва вторинних метаболітів. Встановлено, що під час утворення агрегатів різного розміру між клітинами виникають морфологічні розбіжності, які в умовах масового виробництва поглиблюються ще більше і спричиняють високу гетерогенність культури та ускладнюють суспензійне культивування. Крім того, деякі культури клітин перетворюють позаклітинну сахарозу на полісахариди, які сприяють агрегуванню клітин [1].

Метою даної роботи було отримання культури клітин конвалії (Convallaria majalis L.) та оцінити можливість вирощування калусних культур клітин та подальше їх введення в суспензійну культуру для промислових потреб у виробництві корглікону.

Корглікон – це препарат, що містить суму глікозидів конвалії. За характером дії близький до строфантину. Його застосовують при гострій і хронічній недостатності кровообігу, серцевої декомпенсації, ускладненій тахісистолічній формі мерехтіння передсердь, а також для попередження нападів пароксизмальної такіхардії. Настоянку конвалії, яка є основою лікарського препарату, готують екстракцією 70 %-м етанолом з трави конвалії [2].

Для одержання асептичного вихідного матеріалу рослин, що є необхідною умовою одержання якісного посівного матеріалу, необхідно насіння конвалії після ретельного промивання у мильному розчині простерилізувати у розчині гіпохлориду натрію. Після трикратного промивання дистильованою водою експланти переносять на безгормональне живильне середовище МС.

Одержані асептичні експланти конвалії переносять на живильне середовище МС1, яке містить цитокінін в концентрації 0,05 мг/л, індолілоцтову та гіберелову кислоти у концентраціях 0,5 мл та 0,05 мг/л відповідно.

Одержаний калус при візуальному спостережені був рихлий, світло-жовтого кольору.

Таке співвідношення ауксинів та цитокінінів призвело калусогенезу, що свідчить про непрямий морфогенез. Динаміку калусогенезу на середовищі МС1 можна побачити в наступній таблиці:

 

 

 

 

Динаміка калусоутворення Convallaria majalis L.на середовищі МС1

 

Тривалість культивування, діб

Початкова маса калусу, мг

Маса калусу, мг

Приріст маси, %

7

21,8±1,09

24,0±1,20

9,2±0,46

14

27,2±1,36

11,8±0,59

21

31,4±1,57

13,4±0,67

28

46,2±2,31

32,0±1,60

35

96,4±4,82

52,1±2,61

42

174,2±8,71

44,7±2,24

49

183,1±9,20

4,9±0,25

56

191,8±9,59

4,5±0,23

 

Висновки.

1. В результаті проведених дослідів були одержані асептичні рослини конвалії та підібрано поживне середовище для їх культивування.

2. Приріст маси калюсу конвалії травневої отриманої з насіння на 7—21 добу культивування, становив на середовищі МС1р— 9,2% — 13,4. Максимальний приріст маси калюсу припадає на 35 добу культивування і становить на середовищі МС1р — 52,1%.

В подальшому планується одержати суспензійну культуру з калусу конвалії як основу для посівного матеріалу при глибинному культивуванні, а також підібрати оптимальні умови культивування для синтезу біологічно активних речовин, зокрема глікозидів.

 

 

Література.

1. Кунах В.А., Можилевская Л.П., Губарь С.И. Особенности получения и изменчивость суспензионных культур и клеточных клонов payвольфии змеиной Rauwolfia serpentina in vitro // Биотехнология. – 2001. –  №4. – С. 9-21.

2. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Лєвенко В.О. Основи біотехнології рослин.  – К., 2000. – С. 247.

3. Bressan P.M., Kim Y.P., Hydman S.E. et.al. Factors affecting in vitro propagation of Rose // J. Amer. Soc. Hort. Sci. – 2001. – V. 107. P. 979 – 990

4. Dunstan D.I., Short K.S. Improved growth of tissue cultures of the onion Allium cepa // Physiol. Plant. – 1997. – V.41. – P. 70 – 72.

5. Malepszy S., Solarek E. In vitro culture of Cucumus sativus L. Conditions for cell suspension // Genet, pol. – 2001. – V. 27, N 3-4. – P. 249-253.

6. Reinert J., Yeoman M.M. Plant cell and tissue cultures. A Laboratory Manual // Springer-Verlag. Berlin Heidelberg . – 2001. – P. 83 – 94.

7. Smith D.L., Krikorian A.D. Release of somatic embryo genetic potential from excised zygotic embryos of carrot and polyembryonic cultures in hormone-free medium // Amer. J. Bot. – 1998. – V. 76. – P. 1832 – 1843.