Біологічні науки/5. Молекулярна біологія

Незелюк О.І. ¹, Кравчук І.В. ², Карпов О.В. ¹, Телегеєв Г.Д. ²

Національний університет харчових технологій, Київ, Україна¹

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України²

Вплив РН домену білка Bcr на механізм прогресії Ph’-позитивної лейкемії

Лейкемії – група захворювань, які характеризується безконтрольною проліферацією кровотворних клітин і порушенням їхнього диференціювання[1].

Ph’-позитивні лейкемії характеризуються наявністю філадельфійської хромосоми, яка є результатом реципрокної транслокації між 9 та 22 хромосомами. Результатом цієї хромосомної аберації є утворення гібридного гену bcr-abl, експресія якого призводить до злоякісної трансформації гемопоетичних клітин [1].

Відомі різні варіанти гібридного гена bcr-abl, що відрізняються точками розриву при транслокації. Розриви в гені abl відбуваються таким чином, що вони не змінюють структурну частину гібридного білка, що належить Abl. Ген bcr має три ділянки, в яких розриви відбуваються найчастіше і в залежності від точки розриву bcr, утворюються три різні за довжиною форми білка Bcr-Abl [1] і саме мутації Bcr-фрагмента призводить до зміни в характері захворювання та втрати відповіді на терапію.

Функції Bcr забезпечуються різними його доменами, які мають сайти зв’язування з різними білками клітини. Саме зв’язування з тими, чи іншими білками різних структур клітини при втраті внаслідок мутацій певних доменних компонентів може призводити до різної локалізації білка Bcr-Abl в клітині і обумовлювати різницю в характері та пробігу захворювання [2].

Детальна характеристика доменів білка Bcr може допомогти як у пошуку нових мішеней для лікарських препаратів, так і в з’ясуванні причин розвитку певного фенотипу захворювання та механізмів його прогресії.

Мета роботи – відпрацювати метод візуалізації фагосом за допомогою флуоресцентно мічених бактерій для створення підходів до перевірки колокалізації РН домена білка Bcr з мембраною фагосом.

Об’єктом дослідження була клітинна лінія мишачих макрофагів J774, які отримали із банку Інституту молекулярної біології та генетики НАН України. Підтримували клітинну лінію шляхом пересіву на чашки Петрі з середовищем DMEM (Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) + 10% FВS (сироватка ембріона бика) та інкубували при температурі +37˚С та 5% СО₂.

З накопичувальної культури виділення плазмідного вектора pEGFP-C3 здійснювали методом лужного лізису. Напрацювання необхідної кількості проводили шляхом трансформації плазмідної ДНК в компетентні клітини E.coli. Очищення плазмід здійснювали на мембранних фільтрах. Розрізання плазмідного вектора проводили за допомогою ендонуклеаз Hind IIІ і Bam HI.

Після отримання та відповідної підготовки вектора pEGFP-С3 та вставки РН домена було проведено лігування таким чином, щоб молярне співвідношення вектора до вставки було 1:3. В результаті було отримано генетичну конструкцію pEGFP-С3-РH. Отриману плазміду перевіряли на її відповідність розміру очікуваного фрагменту за допомогою ПЛР. Після чого проводили електрофорез отриманого ПЛР-продукту в 1%-му агарозному гелі.

Шляхом фагоцитозу мишині макрофаги J774 поглинають клітини бактерій E.coli, що можна побачити за допомогою фарбування акридином оранжевим. Але сам акридин оранжевий в наших дослідженнях не підходить, бо дає зелений колір клітинам, що буде перекриватися з РН-GFP (теж зелена флуоресценція). Тому потрібно розробити методику, що дозволить нам провести наше дослідження.

Планується трансфекувати макрофаги конструкцією pEGFP-PH, а візуалізацію фагосом проводити шляхом фарбування бактерій за допомогою флуоресцентного фарбника (кандидати: бромістий етидій та пропідій йодид – червоний колір флуорисценції).

Бромистий етидій і пропідій йодид добре фарбують клітини бактерій E.coli. Але враховуючи дуже малі розміри клітини E.coli, що не дозволяє візуалізувати фагосому, використовували дріжджі S. сerevisiae, які мають більші розміри ніж бактерії E.coli, але менші ніж макрофаги і також фарбуються пропідій йодидом. Проте бромистий етидій фарбує і живі клітини макрофагів. Так як при додаванні пофарбованих ним дріжджів відбувається зафарбовування цієї системи в один колір, що робить неможливим їх розпізнавання, використання цього барвника є недоцільним. Пропідій йодид не фарбує живі макрофаги (за рахунок непроникності через мембрану живої клітини), що дозволяє його використання у дослідженні.

Трансфекцію культури клітин мишачих макрофагів J774 проводили з використанням ДЕАЕ-декстарну генетичною конструкцією pEGFP-С3-РН, з якої буде синтезуватись білок РН-GFP(зелена флуоресценція). Візуалізацію фагосом здійснювали через добу після трансфекції шляхом інкубування культури J774 з дріжджовими клітинами S. сerevisiae, які попередньо були пофарбовані пропідій йодидом. Макрофаги клітинної лінії J774 шляхом фагоцитозу поглинають клітини S. сerevisiae і дають червоне колір флуорисценції.

Трансфекцію можана вважати успішною оскільки візуально у мікроскоп було видно зелену флуоресценцію GFP-PH білка у більшості трансфекованих клітин (70%). Проте флуоресценція була слабкою, що не дозволяло зафіксувати її на камеру разом з програмою, яка стандартно використовувалась для флуоресцентної мікроскопії у відділі. Тому у майбутньому буде здійснено спроби пошуку можливих шляхів вирішення даної проблеми.

Література:

1. Cortes J., Deininger M. Chronic myeloid leukemia // Informa Healthcare USA, Inc. – 2007. Vol.23, №11. – P.163.

2. Ling X. Bcr and Abl interaction: Oncogenic activation of c-Abl by sequestering Bcr // Cancer Research – 2003, № 63, – P. 298–303.