Телегеєв Г.Д., Леонтьєва Д.А., Семенова О.І., Ткаченко Т.Л.

Національний університет харчових технологій, м. Київ, Україна

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, м. Київ, Україна

Одержання рекомбінантного білка Cortactin

Вивчення патогенезу пухлинних захворювань системи крові привело до відкриття одного з провідних принципів онтогенезу: причиною формування злоякісного клону є порушення функціонування нормальних генів. Як правило, це відбувається в результаті хромосомних аберацій, мутацій окремих генів або блокування нормальної регуляції функціонування генів. Генетичну інженерію можна представити як зєднання фрагментів ДНК природного та синтетичного походження з наступним введенням отриманих рекомбінантних структур в живу клітину. Рекомбінантні ДНК стають складовою частиною генетичного апарату рецепієнтного організму і надають йому нових унікальних генетичних, біохімічних, а потім і фізіологічних властивостей. В якості продуцентів рекомбінантних білків людини частіше за все використовують Escherihia coli.

Першим цитогенетичним маркером пухлинного росту стала філадельфійська хромосома. Основу мутації становить перехресна транслокація хромосомного матеріалу між 9ю та 22ю хромосомами. В результаті цього утворюється злитий ген bcr/abl. Більшість попередніх досліджень було зосереджено на Abl частині гібридного білка, адже саме неконтрольована Abl-тирозинкіназна активність вважається однією з провідних причин розвитку хронічної фази мієлоїдної лейкемії. Це дало змогу розробити перший ефективний терапевтичний препарат – інгібітор тирозинової кінази Abl, який, на жаль, не набув широкого вжитку в лікарський практиці, оскільки почали спостерігатися випадки нечутливості до нього внаслідок мутацій у Abl-кіназному регіоні [1].

Дослідженнями, проведеними в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України, було встановлено, що рекомбінантний РН-домен білка Bcr/Abl потенційно може взаємодіяти із рядом клітинних білків, зокрема, Cortactin. Білок Cortactin є нитчастим актин-зв’язуючим білком субстрату онкогенних тирозинкіназ. Cortactin має важливе медичне значення, так як при онкологічних захворюванняї людини експресується в пухлинах та відіграє важливу роль у міграції пухлинниї клітин і метастазуванні [2].

Встановлення факту взаємодії РН-домен онкобілка Bcr/Abl з білком Cortactin дозволяє розширити спектр молекул організму, залучених у взаємодію з гібридним білком, що дасть можливість визначати початкову стадію хвороби.

Для отримання та напрацювання в необхідній кількості фрагменту ДНК, що відповідав послідовності білка Cortactin застосовувався метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Наявність необхідного фрагменту перевірили за допомогою електрофорезу. Його розмір 1600 п.н. (рис. 1).

Рис. 1. Електрофореграма ПЛР-продукту Cortactin

1- маркер GeneRuler DNA Ladder Mix;

2 - ПЛР-продукт

Рис. 2. Електрофореграма розрізаної плазмідної ДНК pGEX-4T-3

1 - маркер молекулярної ваги GeneRuler DNA Ladder Mix; 2 - плазміда pGEX-4T-3, розрізана ендонуклеазою SmaІ

ПЛР-продукт було очищено шляхом переосадження CH3COONa та С2Н5ОН. Після чого було проведено обробку вставки фрагментом Кльонова, що дало змогу позбутися зайвих аденінових нуклеотидів на її кінцях.

В якості вектора для створення конструкції було використано плазміду pGEX-4T-3. Попередньо напрацьована та виділена плазмідна ДНК була розрізана за допомогою ендонуклеази SmaІ по унікальному сайту.

Ефективність цієї процедури перевірялася ДНК-електрофорезом у 1% агарозному гелі (рис. 2). Розмір виділеного вектора склав 4900 п.н. В якості вектора для створення конструкції було використано плазміду рGEX-4T-3.

Після проведення ДНК-електрофорезу плазміду pGEX-4T-3 було виділено з гелю з використанням готового набору Silica Bead Gel Extraction Kit.

Після отримання відповідної вставки, що кодує білок Cortactin та вектора pGEX-4T-3 було проведено лігування.

Для знаходження плазмідної ДНК pGEX-4T-3, яка містили цільову вставку у правильній орієнтації, проводилася полімеразна ланцюгова реакція із використанням прямого праймеру до послідовності плазмідної ДНК та зворотнього до нуклеотидної послідовності цільової вставки: для послідовності Cortactin-Cor-f (прямий), для вектора pGEX-4T-3-pGEX-rev (зворотній).

Для експресії нуклеотидної послідовності, яка відповідала білку Cortactin було проведено трансформацію бактеріальних клітин Е.Соlі конструкцією pGEX-4T-3-Cortactin. Експресію в трансформованих конструкцією pGEX-4T-3-Cortactin клітинах було індуковано за допомогою lmM IPTG. Провели аналітичну експресію білка. Виявили наявність експресії білка, але розмір не відповідає описаному у літературних джерелах (25 замість 25+80кДа).

Результати даної роботи дозволять у майбутньому перевірити наявність взаємодії між РН-доменом білка Bcr/Abl та білком Cortactin, що дасть можливість пошуку молекул-мішеней, взаємодія з якими призводить до хронічної мієлоїдної лейкемії.

Література:

1.     Моисеев С.И., Зарицкий А.Ю., Салогуб Г.Н. Хронические миелопроферативные заболевания. Классификация, диагностика и лечение // Пособие для студентов IV,V,VI курсов, интернов, клинических ординаторов и врачей. – 2005. – 41 с.

2.     Li Y, Tondravi M., Liu J., Smith E., Haudenschild CC., Kaczmarek M., Zhan X. Cortactin potentiates bone metastasis of breast cancer cells // Cancer Res. – 2001. 61. P.6906-6911.