Морфо-иммунологический статус больных с эндокринной офтальмопатией.

К.м.н. Низовибатько О.Б.

Тамбовский Государственный университет им. Г.Р.Державина.

Морфо-иммунологический статус больных с эндокринной офтальмопатией.

Эндокринная офталъмопатия (офтальмопатия Грейвса, аутоиммунная офтальмопатия) - аутоиммунное заболевание, патогенетически связанное с заболеваниями щитовидной железы, характеризующееся отеком и лимфоцитарной инфильтрацией, а в дальнейшем фиброзными изменениями ретробульбарной клетчатки и глазодвигательных мышц.

Эндокринная офталъмопатия (ЭО) чаще возникала на фоне гипертиреоза, который был выявлен в 59,2% случаев. Тем не менее в 18,3%случаев было диагностировано эутиреодное состояние щитовидной железы, а в 16,7% – первичный или ятрогенный гипотиреоз.

Оценка состояния щитовидной железы. Для определения состояния щитовидной железы применялись традиционный пальпаторный и ультразвуковой метод обследования. Ультразвуковое сканирование проводилось всем больным при помощи аппарата Shimadzu SDU - 500C с использованием линейного датчика 7,5 мГц. Исследование проводилось в положении пациентов лежа на спине с небольшой подушкой под шеей.

Определяли расположение, форму, размеры и структуру ЩЖ. Для установления объема измерялись длина, ширина и толщина каждой доли с последующим их умножением и сложением: длина х ширина х толщина левой доли х 0,478 + длина х ширина х толщина правой доли х 0,478 (0,478 - коэффициент эллипсоидности железы для получения объема ЩЖ). Оценка внутренней структуры осуществлялась по характеру эхогенности (нормальная, гипо- и гиперэхогенность), ее однородности, наличию и характеру включений. При наличии ДТЗ характерным является увеличение размеров ЩЖ, гиперэхогенность, «размытая» структура железы. Нормальным считали объем ЩЖ у женщин до 18 мл, у мужчин - до 25 мл. Для определения размеров ЩЖ использовали классификацию ВОЗ (таб.1).

Таблица 1.

Классификация зоба, рекомендованная ВОЗ.

Степень	Результат пальпации и осмотра
Степень 0	зоб отсутствует
Степень 1а	зоб определяется
Степень 1б	зоб пальпируется и виден только при полном разгибании шеи. Эта степень включает также узловой зоб, даже если нет увеличения железы.
Степень 2	зоб, видимый при обычном положении шеи, пальпация не является необходимой для подтверждения диагноза.
Степень 3	очень большой зоб, заметный со значительного расстояния.

Функциональное состояние ЩЖ, степень тяжести тиреотоксикоза оценивали по комплексу клинико-лабораторных данных. Проводилась оценка жалоб, в том числе отражающих функциональное состояние ЩЖ анамнестических сведений, особенно о наличии наследственных факторов, предшествовавшем лечении, различных экзогенных воздействиях, имевших место перед началом заболевания (стресс, инфекция, радиационное воздействие, курение и др.).

Функциональное состояние ЩЖ уточнялось с помощью иммуноферментного исследования базальных уровней свободной фракции трийодтиронин (Т₃), свободной фракции тироксина (Т₄) и тиреотропного гормона (ТТГ) в крови с использованием стандартных наборов реактивов в лаборатории иммунологической диагностики клинического городка СГМУ (зав. Н.В. Кутырева). Полученные данные отражены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты определения Т3, Т4, ТТГ в сыворотке крови.

Показатель	Нормальная величина
Т_{3 общ (}(нмоль/л)	1,17 - 2,18
Т_{3 св} (нмоль/л)	2,3 – 6,3
Т_{4 общ (}(нмоль/л)	58, 3 - 161,6
Т_{4 св}(нмоль/л)	10,3-24,5
ТТГ (мкМЕ/л)	0,2 - 3,4

Оценка офтальмологического статуса. Состояние органов зрения определяли с использованием данных анамнеза, жалоб больных, результатов осмотра офтальмолога, инструментальных и иммунологических показателей.

К числу жалоб, отражающих состояние глаз, относились светобоязнь, слезотечение, быстрая утомляемость глаз при напряжении зрения, ощущение «песка» в глазах, отеки век, двоение в глазах, увеличение размеров глаз, боли в орбитах, ухудшение зрения.

Все больные были осмотрены офтальмологом с подробным описанием офтальмологического статуса. При объективном обследовании оценивались такие показатели, как наличие и выраженность периорбитального отека, птоза, ретракция верхнего века и ее степень, смыкание глазной щели, подвижность глазных яблок по состоянию конвергенции; возможность репозиции глазных яблок; наличие и выраженность диплопии с определением угла косоглазия по Гиршбергу.

При помощи экзофтальмометра Hertel устанавливали наличие и степень выраженности экзофтальма.

Для офтальмоскопического исследования использовали щелевую лампу (Carl Zeiss). В переднем отрезке камеры глаза определяли состояние конъюнктивы (симптом «креста»), лимбальной области и роговицы. При оценке картины глазного дна описывали центральную вену сетчатки и ее ветвей (возможно развитие их расширения и полнокровия), диск зрительного нерва - гиперемия и отек или признаки атрофии.

Для измерения внутриглазного давления (ВГД) применяли стандартный апланационный тонометр и компьютерный бесконтактный тонометр фирмы Humphry (Xpert N CT). Нормальными показателями считали цифры ВГД менее 25 мм.водного столба. Поля зрения определяли по периметру Ферстера, проекционному электрическому периметру и компьютерному периметру (Humphry). Остроту зрения оценивали по проекционной таблице с внутренней подсветкой (Zeiss).

По завершении офтальмологического исследования для установления диагноза ЭО использовали классификацию NOSPECS (1977), согласно которой выделяется шесть классов по тяжести заболевания. Однако данная классификация не позволяет количественно оценить выявленные у больных ЭО изменения органов зрения. В связи с этим, с целью установления степени тяжести, был использован индекс Крисса (1983). Индекс Крисса рассчитывался на основании суммирования баллов имеющихся у больных симптомов.

По степени тяжести ЭО подразделяли следующим образом:

0 степень (без клинических проявлений,

только по результатам КТ) - 0 баллов

1 степень (легкая) - от 1 до 5 баллов

2 степень (средняя) - от 6 до 10 баллов

3 степень (тяжелая) - от 11 до 15 баллов

Визуализация ретроорбитальных тканей осуществлялась при помощи компьютерной томографии (КТ) орбит на томографе фирмы «General Electric» CT Max 640. Проводились снимки орбит с интервалом шага 2 мм; толщиной среза 2 мм в аксиальной плотности. Определяли размеры мышц с расчетом мышечного индекса, их плотность, состояние клетчатки орбиты, ее плотность, размеры, индекс протрузии, глубину глазницы (таб.3).

Мышечный индекс является интегральным показателем, полученным в результате суммации размеров мышц глаз, и рассчитан по методу R.Nugent (1990).

Таблица 3.

Показатели компьютерной томографии орбит у здоровых людей.

Показатели	Норма
Размеры мышц глаз (мм): нижняя прямая	4,3± 0,8
верхняя прямая	3,5± 0,7
медиальная прямая	3,9± 0,5
латеральная прямая	2,4± 0,6
Плотность мышц (ED): нижняя прямая	+60+90
верхняя прямая	«-»
медиальная прямая	«-»
латеральная прямая	«-»
Глубина глазницы (мм)	24,1± 1,2
Плотность клетчатки (ED)	-80-90
Индекс протрузии (мм)	13-18
Толщина зрительного нерва в орбите (мм)	5,5± 0,7
Мышечный индекс (мм)	14,1± 1,4

Глубина, или размеры, глазницы определялась по расстоянию от основания глазного яблока до вершины глазницы (в мм). Индекс протрузии глазного яблока устанавливали на основании измерения расстояния от роговичного отдела глазного яблока до линии, соединяющей наружные латеральные костные стенки орбиты.

Также проводилась ультрасонография орбит с помощью ультразвукового диагностического аппарата A-Slesh, A/B-skan system 835 Humphry.

Определяли толщину экстраокулярных мышц, их акустическую плотность, акустическую плотность мягких тканей орбиты (таб.4).

Таблица 4.

Нормальные показатели ультрасонографии орбит.

Показатели	Норма
Толщина экстраокулярных мышц (мм): нижняя прямая	4,31± 0,08
верхняя прямая	4,23± 0,04
медиальная прямая	4,0± 0,03
латеральная прямая	3,9± 0,05
Акустическая плотность мышц (ЕД)	-34
Акустическая плотность мягких тканей орбиты (ЕД)	-49

Наряду с инструментальными методами исследования для выявления и оценки тяжести течения ЭО использовали ряд иммунологических методов.

Патогенез ЭО характеризуется выраженными изменениями популяционной и субпопуляционной гетерогенности и функциональной активности иммунокомпетентных клеток как в ретроорбитальных тканях, так и в циркуляции.

В настоящее время хорошо известно, что с изменением функциональной активности лимфоцитов, структуры их поверхностных антигенов меняется физическое состояние клеточных мембран и, в первую очередь, электрический заряд.

Известно, что биологические мембраны представляют из себя жидко-кристаллические бислойные фосфолипидные структуры, в которых «плавают» молекулы белков, а углеводы, конвалентно связанные с протеинами и липидами, находятся на наружной поверхности мембран. Клеточные мембраны обладают поверхностным ионным зарядом, который играет важную роль в процессах, обеспечивающих жизнедеятельность клетки, и обусловлен наличием гидрофильных полярных групп, ориентирующихся в сторону водной среды. Электрофоретическая подвижность клетки (ЭФП) определяется теми некомпенсированными зарядами, которые находятся в данный период жизнедеятельности клетки и при данных параметрах среды в плоскости скольжения - в соответствии с физико-химической теорией электрофореза. Количество этих зарядов может изменяться в результате перемещения зарядов вдоль поверхности клетки, перераспределения ионов, молекул вокруг клетки и внутри клетки под влиянием пассивного и активного транспорта через клеточную поверхность. Препаративная электрофоретическая сортировка лимфоцитов проводилась с помощью свободного распределительного электрофореза на аппарате Elphor Vap 5. Принцип метода состоит в том, что суспензия лимфоцитов подается в вертикальную камеру, в которой создается электростатическое поле. Клетки, несущие отрицательный заряд, отклоняются к положительному электроду. Угол отклонения зависит от величины отрицательного заряда клетки, определяющего ее электрофоретическую подвижность, и скорости потока буферного раствора, который увлекает клетки в вертикальном направлении. В нижней части камере имеются отсеки для сбора клеточных фракций. Чем меньше порядковый номер фракции, тем выше ЭФП клеток.

В соответствии с современными представлениями, важнейшим регуляторным механизмом реализации аутоиммунных воспалительных процессов (в том числе повреждения ретробульбарных тканей при ЭО) является экспрессия межклеточных молекул адгезии ICAM (Intercellular Adhesion Molecules). Семейство ICAM включает три вида функционально гетерогенных молекул: ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3. Особый интерес представляет молекула ICAM-1. ICAM-1 может существовать в двух формах - мембранно-связанной и растворимой (sICAM-1). Количество sICAM-1 закономерно коррелирует с активностью клинических проявлений при заболеваниях с выраженным аутоиммунным компонентом - рассеянный склероз, диффузный токсический зоб, ЭО, системный васкулит и др. Концентрация sICAM-1 в сыворотке крови определялась иммуноферментным методом с помощью коммерческого набора Bedneer Med System, Vienna, Austria. Образцы сыворотки разбавлялись физиологическим раствором в соотношении 1:100 и помещались в лунки микропланшета, покрытые мышиными моноклональными антителами против человеческой sICAM-1. Затем добавляли конъюгат и инкубировали исследуемые пробы в течение 2-х часов при комнатной температуре. После этого лунки тщательно промывали и на 10минут вносили субстрат для развития ферментативной реакции. Останавливали реакцию с помощью 4 N серной кислоты. Оптическую плотность образцов определяли на спектрофотометре при длине волны 450 мм. Используя калибровочную кривую, рассчитывали количество sICAM-1 в 1 мл сыворотки (нг/мл).

Показатели клеточного иммунитета характеризовали с помощью методики непрямой иммунофлюорисценции для определения фенотипа лимфоцитов с помощью моноклональных антител (МКА). Анализ готовых образцов проводился с помощью люминисцентного микроскопа. Использовали комерческие наборы МКА серии ИКО, «Диагнотех».

Материалом исследования служила кровь из локтевой вены с добавлением гепарина (15-20 ед. в 0,1 мл на 1 мл крови). После осаждения эритроцитов в термостате надосадочную жидкость, содержащую лейкоциты, переносили в чистые пронумерованные пробирки. Клетки отмывали путем добавления в каждую пробирку полной рабочей среды (ПРС) и центрифугировали. Процедуру промывания повторяли несколько раз. Затем к осадку клеток добавляли 0,5 мл ПРС, взвесь разливали в лунки 96-луночных круглодонных плейтов; плейты центрифугировали и вносили МКА (предварительное разведение). После охлаждения в холодильнике дважды отмывали от МКА с помощью ПРС и центрифугирования плейт с последующей процедурой докрашивания путем добавления в каждую лунку антимышечных ФИТЦ, меченных антител в соответствующем разведении. В последующем в охлажденные плейты добавляли ПРС и центрифугировали, лизировали оставшиеся в пробе эритроциты, вновь центрифугировали и сбрасывали надосадочную жидкость. Процедуру с добавлением ПРС и центрифугированием повторяли, сброшенную надосадочную жидкость фиксировали параформальдегидом. После фиксации взвесь клеток помещали на очищенное предметное стекло на 20 минут для осаждения клеток, затем под струю холодного воздуха (под вентилятор) для уменьшения объема жидкости. Добавлялась капля 5% глицерина на фосфатном буфере, сверху аккуратно накладывалось покровное стекло.

Под микроскопом определялся процент светящихся клеток при объективе х 90. В качестве иммерсионного средства использовали 70% глицерин, приготовленный на фосфатном буфере. В 1 образце просчитывалось 200-500 клеток. Результаты определения субпопуляций Т-лимфоцитов у здоровых людей отражены в таблице 5.

Таблица 5.

Показатели клеточного и гуморального иммунитета.

Показатели иммунитета
CD3+(Т-клетки),%	67,3± 3,4
CD4+(Т-хелперы/индукторы),%	47,8± 3,8
CD8+(Т-супрессоры/цитотоксические клетки), %	23,2± 6,2
CD4+/CD8+(Т-хелперы/ супрессоры), %	2,1± 0,16
CD16+(натуральные киллеры), %	14,4±2,2
CD22+(В-лимфоциты),%	17,5± 4,7
CD25+(рецептор ), %	13,8± 3,6
CD54+(sICAM-1), нг/мл	205± 25
Иммуноглобулины крови: IgA, г/л	2,65± 0,2
IgG, г/л	15,8± 1,1
IgM, г/л	1,24± 0,15

Исследование гуморального иммунитета заключалось в исследовании сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G турбидиметрическим методом. Метод основан на реакции между иммуноглобулином (антиген) и специфической сывороткой (антитело). В результате этой реакции формируются нерастворимые комплексы, повышающие мутность раствора, которая измеряется спектрофотометрически (турбидиметрический метод) при волне 340 нм.

Для исследования иммуноглобулинов использовали комерческие сыворотки МО "Маркет. Мед. Сервис", г.Пермь.

Диагноз ЭО верифицировали при установлении степени тяжести по индексу Крисса, характера течения, стадии и формы развития.

В зависимости от характера течения ЭО выделяли следующие формы:

стабильное течение;

регрессирующее течение;

рецидивирующее течение;

прогрессирующее течение.

Стабильным течение ЭО мы считали в тех случаях, когда субъективные проявления у пациентов были минимальными, отсутствовала тенденция к увеличению орбитального индекса (ОИ) и рецидивы болезни возникали не чаще, чем один раз в 2 - 3 года.

При регрессирующем течении отмечалось постепенное уменьшение клинических проявлений ЭО со снижением ОИ и стабилизацией процесса в орбитах с достижением стойкой и длительной ремиссии.

Рецидивирующий вариант характеризовался волнообразным течением с отчетливой сезонностью развития обострений болезни - в осенне-весенний период; при этой форме также возможно существование длительной ремиссии.

Для прогрессирующей формы ЭО типичным было нарастание всех симптомов заболевания с увеличением индекса Крисса, при этом в дальнейшем регресс глазных симптомов являлся незначительным и в лучшем случае наблюдалась стабилизация процесса. Данная форма в ряде случаев осложняется формированием стойкого угла косоглазия, развитием глаукомы, нейропатии зрительного нерва, изменениями роговицы и, соответственно, снижением остроты зрения.

Кроме того, в течении ЭО выделялись две стадии:

1) воспалительно-инфильтративная;

2) фиброзирующая.

Использование клинических данных в сочетании с результатами КТ и УЗИ орбит позволили выделить 3 формы:

1) с преимущественным поражением мышц глаз;

2) с поражением клетчатки орбиты;

3) смешанные формы.

Литература.

1. Khoo D.H. Should beta-bloking agents be used in thyroxic heart disease /D.H.Khoo, S.C.Ho, L.L.Seah. //Thyroid. –2009.- Vol.9.- P.1175-80.

2. Krassas G.E. Somatostatin receptor scintigraphy before and after treatment with somatostatin analogues in patients with thyroid eye disease / G.E.Krassas, A.N.Dumas. //J. Endocrinol. Invest. –2007.- V.20.- P.62.

3. Krassas G.E. Lantreotide in the treatment of patients with thyroid eye disease / G.E.Krassas, T.H.Kaltsas. //Eur. J. Endocrinol. –2011.- V.136.- P.416-22.

4. Koshivama H. Effects of thyroid hormones on heart and kidney functions /H.Koshivama, T.Koh, K.Fujiwara. //Thyroid.- 2010.- Vol.4.- P.409-413.