Молекулярно-генетические методы анализа поливаринтности некоторых видов Veronica L

Молекулярно-генетические методы анализа поливаринтности некоторых видов Veronica L.

¹ «Вятский государственный гуманитарный университет»( г. Киров)

²«Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского»( г. Нижний Новгород)

³МАОУ "Средняя общеобразовательная школа №2 с углубленным изучением иностранных языков" (г. Ноябрьск, ЯНАО)

Известно, что для многих видов Veronica L. свойственна поливариантность развития (Савиных, 2002, 2006 и др.). Особенно это характерно для V. anagallis-aquatica L. из секции Beccabunga. На основании морфологической поливариантности особей в наземных популяциях этого растения выделены несколько самостоятельных видов: V. poljensis, V. heureka, V. anagallis-aquatica subsp. аnagalloides, V. anagalloides, V. tenuis (Клинкова, Папченков). Они отличаются по ряду морфологических признаков: опушение растения, форма коробочек, строение околоцветника, листьев и др. Однако единого мнения о самостоятельности этих видов нет (Еленевский, 1978; Щербаков, 2009 и др.). В то же время известны значительные сходства в морфологии и наборе хромосом у V. beccabunga L. и V. peregrina со значительными различиями в ареале, на основании чего высказана гипотеза о возможной гидрофильной линии в эволюции однолетних видов вероник, в частности при возникновении V. peregrina (Савиных, 2002, 2006 и др.). В связи с этим сравнение и полная идентификация новых видов однолетних вероник из группы V. anagallis-aquatica L. представляется актуальной.

В последние годы появилась серия работ (Бобров, 2009; Синюшин, 2010, Сулейманова, 2010) по идентификации видов с помощью молекулярно-генетических методов. Апробированы к настоящему времени и предлагаются для изучения следующие: использование ДНК-маркеров на основе полимеразой цепной реакции, метод штрих-кодирования, метод секвенирования (Зеленин, 2003, Синюшин, 2010). Использование генетических методов позволит точно установить таксономический ранг вновь выделенных таксонов.

Известно, что использование в качестве маркерных систем полиморфных последовательностей ДНК, созданных на основе ПЦР, позволило решить проблему насыщения геномов маркерами и маркировать практически любые участки ДНК. Успехи в развитии генетических исследований обусловлены наличием информативных генетических маркеров. В настоящее время возможно использования некоторых молекулярно-генетических методов для идентификации видов. Развитие молекулярных методов исследований позволило создать новые тест-системы, позволившие анализировать генетический полиморфизм и поливариатность организмов на уровне продуктов генов (белковый или биохимический полиморфизм) и на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК).

Для того чтобы выявить полиморфизм генов растений в различных регионах России и мира не обязательно делать сбор материала в разных географических областях, достаточно взять гербарные образцы и выделить ДНК из них методом СТАВ - буфера.

Нужно приготовить два раствора. Двукратный СТАВ-буфер на 100мл:

2.0 М трис-HCL, рН(8.0)- 5.0 мл, 5.0 М NACL-28.0 мл, 0.5 М ЭДТА- 4.0 мл

СТАВ- 2.0 г. И буфер для экстракции ДНК на 15 мл: 1% PVP- 0.15 г, 1%NA₂S0₃ -0.15 г, двукратный СТАВ-буфер до 15 мл. Буфер готовим без 2-Меркаптоэтанола (2-МЭ). Непосредственно перед использованием добавляют соответствующую аликвоту 2-МЭ, что составляет 2мкл на 1000 мкл.

1. Взвесить 0.05 - 0.07 гр. гербарного материала с удаленными главными жилками.

2. Буфер для экстракции ДНК и ступку с пестиком нагреваем при 60° С в термостате.

3. Растираем гербарный материал в горячем буфере до получения гомогенной массы, затем растертую ткань (в объеме 600-800 мкл) помещаем в 2.0 мл эппендорфы. Тщательно перемешиваем на мешалке.

4. Эппендорфы помещаем в термостат и инкубируем при температуре 56° С в течение 20-40 минут. Время от времени необходимо постукивать по дну пробирок, чтобы перемешивание происходило интенсивнее.

5. Добавляем 2/3 объема хлороформа и тщательно перемешиваем. Центрифугируем 3-5 мин (13000 об.). Переносим верхнюю водную фазу в чистые 2.0 мл эппендорфы.

6. Повторяем экстракцию хлороформом. Снова переносим верхнюю фазу в чистые 2.0 мл эппендорфы.

7. Добавляем 2/3 объема холодного изопропанола, перемешиваем и оставляем в морозильнике (-18° С) на 20 минут.

8. После осаждения осадок центрифугируем 1-2 минуты. Верхнюю фазу аккуратно сливаем.

9. Промываем осадок 80% спиртом с 0.01 М ацетатом натрия. Аккуратно перемешиваем. Центрифугируем 1 минуту, верхнюю фазу сливаем. Осадки подсушиваем.

10. Осадок растворяем в стерильной дистиллированной воде.

При осаждении изопропанолом можно держать не 20 минут, а 5-10 либо 20, но при комнатной температуре, а не на минус 20. Растворять в 30-50 мкл. Для ПЦР может понадобиться разводить исходную ДНК в 10-100 раз. Для очень старых образцов и/или малых количеств (менее 10-20) материала не работает.

Следующий метод- это использование биохимических маркеров. Первыми молекулярными маркерами были маркеры, созданные на основе анализа белкового полиморфизма. Использование нескольких сотен биохимических маркеров позволило оценить уровень генетического полиморфизма у более 2000 биологических видов (от микроорганизмов до человека) и разработать основные теоретические положения популяционной генетики. Прежде всего, это то, что анализ белков позволяет исследовать полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей и только у экспрессирующихся генов. При этом из анализа исключаются такие функционально-значимые участки, как промоторные области, энхансеры, различные сайты регуляции, расположенные в интронах, нетранслируемых областях генов, а также вне генов, часто на значительном расстоянии от кодирующей последовательности. Более перспективным представляется использование в качестве маркерных систем полиморфных нуклеотидных последовательностей ДНК, позволяющих тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генов, а не на уровне продуктов генов, как в случае использования метода белкового полиморфизма. ДНК-маркеры позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе некодирующие. Кроме того, эта маркерная система дает возможность использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма и имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими типами маркеров.

ДНК-маркеры, основанные на анализе рестрикционного полиморфизма. Открытие и выделение рестрицирующих эндонуклеаз (рестриктаз), расщепляющих ДНК в участках со строго определенной последовательностью, позволило разработать маркеры на основе анализа рестрикционного полиморфизма ДНК. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, англ. RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism). Впервые ПДРФ был использован как генетический маркер в 1974 г. при идентификации термо-чувствительной мутации в геноме аденовируса. Однако широкое применение вариантов полиморфизма ДНК в качестве генетических маркеров началось с 1980 г. после выхода основополагающей работы Ботштейна с соавт, в которой были изучены свойства ПДРФ как генетического маркера, дано теоретическое обоснование его использования и предложен метод оценки уровня информативности (PIC - polymorphism information content). ПДРФ используют для анализа полиморфизма конкретных локусов (генов). Способ анализа ПДРФ сводится к обработке ДНК рестриктазами с последующим электрофоретическим разделением полученной смеси и определением длин рестрикционных фрагментов после блот-гибридизации со специфическим меченым зондом. Так как рестрицирующие эндонуклеазы имеют строго специфические места расщепления, то генетические различия в нуклеотидной последовательности ДНК между индивидуумами (т.е. полиморфизм на уровне ДНК) приведут к различному распределению сайтов рестрикции вдоль соответствующих молекул ДНК и получению продуктов рестрикции, в которых длина гомологичных фрагментов будет различаться. Таким образом, полиморфизм ДНК будет тестироваться как ПДРФ. Подробнее с методологией ПДРФ можно ознакомиться в многочисленных обзорах. Основной причиной, приводящей к возникновению полиморфизма ДНК, первоначально считались точковые мутации (а также микроделеции и инсерции), затрагивающие сайты узнавания тех или иных эндонуклеаз рестрикции. В последующих работах спектр возможных причин был расширен, и в настоящее время основная роль отводится таким факторам, как крупные делеции и вставки, трансверсии, транслокации, транспозиции мобильных генетических элементо и т.п. Кроме того, некоторые рестриктазы не способны расщеплять ДНК, если сайт узнавания содержит один или несколько метилированных цитозиновых остатков. Такие ферменты также могут выявить полиморфизм, если имеются вариации в характере метилирования. С использованием ПДРФ-маркеров были получены первые успешные результаты по построению молекулярно-генетических карт многих видов растений и животных, накоплены обширные сведения о генетическом полиморфизме различных организмов, выявлены ассоциации с хозяйственно-полезными признаками. Важным достоинством данного типа маркеров является высокая воспроизводимость результатов, а также кодоминантный тип наследования. ПДРФ-локусы могут обладать множественными аллелями, что повышает их информативность. ПДРФ-анализ митохондриальной ДНК и кластера генов, кодирующих рибосомные РНК (рДНК), широко используется в популяционной генетике, биогеографических и филогенетических исследованиях. Высокий консерватизм ПДРФ-маркеров позволяет использовать их при сравнительном картировании родственных видов. Например, появление детальных генетических карт многих растений позволило сравнить между собой ряд геномов, благодаря использованию общего набора ПДРФ-зондов.

ДНК-фингерпринт (синоним - "геномная дактилоскопия") позволяет исследовать полиморфизм множества локусов повторяющихся последовательностей (мультилокусный анализ). Анализ проводится тем же способом, что и в случае ПДРФ, но в качестве специфического гибридизационного зонда используются последовательности повторяющихся последовательностей - минисателлитов. Минисателлиты диспергированы по геному и представляют собой последовательности, состоящие из многократно повторенной единицы ("мотива" или "коровой" последовательности) длиной от 9 до 100 и более п.н. (тандемно повторяющиеся последовательности). Отдельные последовательности отличаются друг от друга по общей длине (числу повторов "мотива"), а также по некоторым вариациям в нуклеотидной последовательности "мотива". Использование "коровых" последовательностей в качестве зондов при гибридизации позволяет выявлять множество участков рестрикционного полиморфизма и получать высокоспецифическую картину гибридизации геномной ДНК, характерную для конкретного индивида (особи). Показано, что с помощью данного подхода в геноме млекопитающих можно выявить более 30 высокополиморфных локусов, что достаточно для индивидуальной идентификации человека, растений, животных). Основными механизмами возникновения и поддержания полиморфизма в минисателлитах считаются неравный кроссинговер и генная конверсия. При этом высокую вариабельность (нестабильность) минисателлитов связывают не с внутренним свойством повторяющейся последовательности, а с инициатором мутаций, фланкирующим повтор, и активацией мутагенных систем генома. Скорость мутационного процесса в гипервариабельных минисателлитных локусах человека выше, чем в целом для геномной ДНК, и составляет в среднем на гамету 10-4 на 1 т.п.н. минисателлита. В силу чрезвычайно высокого полиморфизма этот тип маркеров не применяется в популяционных или филогенетических исследованиях, а используется для индивидуальной идентификации человека, растений и животных.

ДНК-маркеры, основанные на полимеразной цепной реакции

Мощным толчком для создания новых типов ДНК-маркеров стало изобретение Кэри Мюллисом в 1983 г. метода амплификации in vitro определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов полимеразной реакции (ПЦР - полимеразная цепная реакция, англ. PCR - Polymerase Chain Reaction).

Метод ПЦР позволяет быстро и с небольшими затратами материальных ресурсов и времени получить более 10 миллионов копий определенной последовательности ДНК, первоначально представленной одной или несколькими молекулами. Различные модификации метода ПЦР легли в основу создания разнообразных типов ДНК-маркеров, широко используемых в настоящее время в различных областях биологии и медицины. Классификация ДНК-маркеров до сих пор не сформирована, что объясняется не только их многообразием, но и тем, что при введении тех или иных модификаций в известный метод, авторы часто дают новое наименование получаемым ими маркерам. Предложено объединить ДНК-маркеры, созданные на основе ПЦР, в два основных класса: маркеры, созданные на основе небольших изменений в нуклеотидной последовательности ДНК уникальных локусов, и маркеры на основе изменения числа повторов в тандемно повторяющихся последовательностях ДНК. Очевидно, что такая классификация недостаточна, поскольку перечисленные классы гетерогенны и включают в себя ДНК-маркеры, резко различающиеся по своим свойствам. Кроме того, сюда не включены маркеры, которые использовались как мономорфные маркеры при построении физических карт хромосом человека и других организмов. В данном обзоре предпринята попытка более детальной классификации и характеристики ДНК-маркеров, созданных на основе ПЦР.

Полиморфизм длин продуктов амплификации (AFLP-маркеры).

Для исследования вариабельности генома в целом может быть также использован метод анализа AFLP. Этот метод также не требует ни предварительного клонирования, ни секвенирования ДНК. Особености этого подхода заключаются в использовании в качестве матрицы рестрицированных фрагментов ДНК, лигированных со специфическими олигонуклеотидными адаптерами, и проведении избирательной амплификации со специально сконструированными праймерами. Праймеры состоят из фиксированной части, содержащей последовательность, комплементарную адаптеру и сайту рестрикции использованной эндонуклеазы (~ 15 нуклеотидов), и короткого фрагмента (на 3'-конце) с произвольной последовательностью нуклеотидов (2-4 нуклеотида). Фиксированная часть придает праймеру стабильность и, в результате, хорошую воспроизводимость метода, а короткая последовательность со случайным набором нуклеотидов позволяет определять и контролировать пропорцию лигированных фрагментов, которые могут быть амплифицированы. С каждой парой праймеров амплифицируется 75-100 фрагментов (AFLP-финргерпринтинг), которые разделяют в агарозном или полиакриламидном геле. Поскольку каждый фрагмент представляет собой уникальный сайт, количество локусов, анализируемых одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при любой другой технике анализа полиморфизма ДНК. С одного геля обычно удается получить до 40 полиморфных локусов. Этот тип полиморфизма ДНК также имеет доминантный тип наследования. AFLP-маркеры часто наследуются как тесно сцепленные кластеры в районе центромеры или теломеры хромосом, но наблюдается и случайное распределение маркеров вне этих кластеров, что позволяет, используя этот подход, быстро генерировать сотни высоковоспроизводимых маркеров. AFLP-маркеры были успешно использованы для геномного картирования, в популяционных и филогенетических исследованиях. В последние годы эти маркеры получают все более широкое распространение для исследования мало изученных таксономических групп.