С.А. Аубакирова, О. А. Тен, Д. С. Балпанов
АНАЛИЗ 12
МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ У ПОРОД ОТЕЧЕСТВЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Филиал РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии Республики
Казахстан», КН МОН РК в г. Степногорск
E-mail: ipbncbrk@mail.ru
АННОТАЦИЯ
В последнее
десятилетие селекционеры активно используют маркеры ДНК для подтверждения
достоверности происхождения племенных животных. Генотипирование ДНК признано
международным сообществом наиболее надежным и эффективным методом анализа
родословной.
В качестве маркеров ДНК используются
микросателлиты (STR, Short Tandem Repeats), которые являются удобными
генетическими маркерами из-за относительно несложной методики определения,
высокого уровня полиморфизма и стабильного аутосомного кодоминантного
наследования. Основными требованиями к микросателлитным локусам являются:
высокий уровень полиморфизма, подходящий размер аллеля, низкая степень мутаций,
«работоспособность» праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР), отсутствие
нулевого аллеля и генетическая независимость от других локусов.
В
статье приводятся результаты приводятся анализа микросателлитных маркеров у пород отечественной селекции. В результате генотипирования по
микросателлитным локусам обнаружены индивидуальные различия, что позволяет
использовать полиморфизм микросателлитных локусов для генетической
паспортизации животных и оценки достоверности их происхождения.
Введение
С открытием микросателлитов появилась возможность точно определить
достоверность происхождения животных, а так же осуществить маркировку некоторых
генетических локусов, связанных с продуктивностью.
Исследование крупного рогатого скота по микросателлитам и
построение на их основе специфических ДНК-профилей пород, типов и линий
позволяет использовать данные анализа в планировании селекционной работы в
популяциях сельскохозяйственных животных.
Породы и популяции крупного рогатого скота
различаются по количеству аллельных вариантов и уровню гетерозиготности
изученных микросателлитных локусов. В настоящее время микросателлиты составляют
значительную группу генетических маркеров, удобных для целого ряда
исследований, таких как характеристика генетической структуры популяций и
степени инбредности, оценка генетических расстояний между семействами, линиями,
породами и видами животных, филогенетических исследований.
Благодаря открытию наследственного полиморфизма нуклеотидных
последовательностей ДНК появилась возможность надежной генетической
идентификации племенных животных с достижением максимальной эффективности контроля
происхождения [2].
Наряду с проведением генетической экспертизы в племенной работе возникает
необходимость в генетическом контроле направленности селекционных процессов в
популяциях крупного рогатого скота, а также в паспортизации отдельных животных
для установления их племенной ценности.
С этой целью в мировой практике широко используются микросателлитные
последовательности ДНК, которые играют доминирующую роль в качестве
неисчерпаемого источника генетических маркеров. В настоящее время выделено и
описано более 2000 микросателлитов в геноме крупного рогатого скота (база
данных INRA, Франция) и их количество увеличивается с каждым днем [3,4].
Оценка происхождения по микросателлитным
маркерам точнее, чем по группам крови. Поэтому в мировой практике при продаже
племенных животных за рубеж требуется подтверждение их происхождения по данным
анализа микросателлитной ДНК. Существуют рекомендации ФАО, какие микросателлиты
использовать для генетической оценки крупного рогатого скота (8).
Ключевые слова: микросателлитные
маркеры, ДНК, ПЦР, крупный рогатый скот,
Материалы и методы
исследований
Материалом
для выполнения данной работы послужила цельная кровь крупного рогатого скота
аулиекольской и казахской белоголовой породы.
Проанализировали ДНК, выделенную
из крови 50 животных пород отечественной селекции. Сбор крови животных
осуществляли из разных районов Акмолинской и Северо-Казахстанской областей. Список племенных
хозяйств КРС представлены в таблице 1.
Таблица 1- Перечень племенных
хозяйств КРС
|
Племенные хозяйства |
Порода |
Название области |
|
ТОО
"АКА" |
аулиекольская |
Акмолинская область |
|
ТОО "Нанар" |
казахская белоголовая |
|
|
ТОО
"Столыпинское" |
аулиекольская |
Северо-Казахстанская
область |
|
ТОО "Новобратское
и К" |
казахская белоголовая |
Акмолинская область |
Забор образцов крови производили из яремной вены животных, в
специальные одноразовые пластиковые пробирки содержащие антикоагулянт. Образцы крови хранили при +4ºC
не более одного месяца.
Выделение
ДНК из цельной крови КРС проводили с использованием метода высаливание.
Концентрация полученных ДНК составила 60нг/мкл.
Наличие ДНК,
полученных методом высаливание проверяли с помощью горизонтального электрофореза в 0,8% агарозном геле.
Использовали 12 микросателлитных маркеров: INRA005, BM2113, INRA063, ETH225, OCAM, HEL13, CSSM66, ETH10, INRA023, SPS115, BM1818.
Полимеразную цепную реакцию
проводили на амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США). В
качестве матрицы использовали ДНК ранее выделенную из цельной крови крупного
рогатого скота.
Реакционная смесь объемом 20
мкл содержала: 10 нг ДНК матрицы, 10 пМоль прямого и обратного флуоресцентно-меченными
праймерами (Sigma), 2 мл 10х буфер для Taq-ДНК полимеразы (Медиген, Россия, катал. №
512050), 2 мл (1,5-3mM) MgCl2
(Медиген, Россия, катал. № 512050), 2мл 0,2 mМ дНТФ
(Медиген, Россия, катал. № 322100, 25 мМ каждого), 1 ед. Taq-ДНК полимеразы (Медиген, Россия, катал. № 510050). Условия
проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) были оптимизированы ранее.
Микросателлиты с резко различающейся длиной аллелей анализировали по парам.
Продукты ПЦР разделяли в 6 % полиакриламидном геле и капиллярном электрофорезе.
Длину микросателлитов
измеряли на приборах ALF Express automated DNK sequencer («Pharmacia», Швеция)
и MegaBACE™ 500 DNA sequencer («Amersham Biosciences», США). Для идентификации
аллелей микросателлитных локусов использовали программу ALF Win Fragment
Analyser 1.00.36. Точную длину аллеля определяли сопоставлением с размерами
аллелей у маркерных животных. В результате получали графики, по расположению
пиков которых устанавливали длину микросателлита(п.н.). Каждый локус оценивали
по длине, числу аллелей, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности,
Fis-коэффициенту, внутрипопуляционный полиморфизм — по общему числу выявленных
аллелей, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности (несмещенная оценка),
среднему числу аллелей на локус, числу частных и эффективных аллелей,
Fis-коэффициенту с учетом доверительного интервала.
Для статистического анализа данных использовали программы GE-NEPOP, Genetix,
Convert.
Результаты
и обсуждение
Согласно
рекомендациям NIST (National Center for Biotechnology Information), представленные маркеры являются
оптимальными для проведения генотипирования и паспортизации крупного рогатого
скота.
В различных сочетаниях данные маркеры входят в состав наборов Bovine
Genotypes™ Panels 1.2, Bovine Genotypes™ Panels 2.2 и Bovine Genotypes™ Panels
3.1. используемых для определения происхождения и идентификации КРС.
Подобранные микросателлитные локусы
обладают высокой полиморфностью, характерны для крупного рогатого скота и не
встречаются у других одомашненных видов животных. Микросателлитные локусы
используются для исследования биоразнообразия крупного рогатого скота. Основными показателями,
наиболее часто использующимися для характеристики полиморфизма микросателлитов
ДНК в различных популяциях и породах животных, является число наблюдаемых
аллелей в локусе и частота встречаемости аллелей, выявленных в каждом
индивидуальном локусе, а также степень гетерозиготности [6].
В
нашей работе проанализировано ДНК КРС, выделенная из образцов цельной крови 50
животных двух пород отечественной селекции. Использовали 12 микросателлитных
маркеров: INRA005, BM2113, INRA063, ETH225, OCAM, HEL13, CSSM66, ETH10, INRA023, SPS115, BM1818. В результате проведенного исследования
для каждого образца ДНК получен индивидуальный геномный профиль по 12 локусам
микросателлитной ДНК.
Данные, характеризующие полиморфизм 12
микросателлитных локусов ДНК крупного рогатого скота аулиекольской породы
представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Результаты анализа 12микросателлитов ДНК КРС аулиекольской породы.
Таблица 2- Перечень пар праймеров к микросателлитным
локусам КРС
|
Наименование локуса |
Аллель |
Количество голов КРС |
Гетерозиготность |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
|
INRA005 |
91 |
14 |
0,1558 |
|
94 |
12 |
0,1276 |
|
|
98 |
13 |
0,1326 |
|
|
100 |
11 |
0,11 |
|
|
BM2113 |
120 |
19 |
0,1583 |
|
124 |
15 |
0,1209 |
|
|
127 |
16 |
0,1259 |
|
|
INRA063 |
166 |
24 |
0,1445 |
|
170 |
26 |
0,1529 |
|
ETH225 |
190 |
13 |
0,0684 |
|
192 |
10 |
0,0520 |
|
|
194 |
14 |
0,0721 |
|
|
196 |
13 |
0,0663 |
|
|
OCAM |
224 |
17 |
0,0758 |
|
227 |
10 |
0,0440 |
|
|
230 |
9 |
0,0391 |
|
|
235 |
14 |
0,0595 |
|
|
HEL13 |
238 |
18 |
0,0756 |
|
240 |
21 |
0,0875 |
|
|
242 |
11 |
0,0454 |
|
|
CSSM66 |
111 |
16 |
1,4545 |
|
115 |
24 |
0,2086 |
|
|
117 |
10 |
0,0854 |
|
|
ETH10 |
150 |
12 |
0,08 |
|
153 |
15 |
0,0980 |
|
|
155 |
21 |
0,1354 |
|
|
158 |
13 |
0,0822 |
|
|
INRA023 |
204 |
5 |
0,2450 |
|
208 |
10 |
0,0480 |
|
|
210 |
12 |
0,0571 |
|
|
212 |
11 |
0,0518 |
|
|
214 |
8 |
0,0373 |
|
|
218 |
4 |
0,0183 |
|
|
SPS115 |
133 |
13 |
0,0977 |
|
135 |
8 |
0,0592 |
|
|
138 |
5 |
0,0362 |
|
|
142 |
10 |
0,0704 |
|
|
145 |
14 |
0,0965 |
|
|
BM1818 |
248 |
18 |
0,7258 |
|
250 |
14 |
0,056 |
|
|
252 |
18 |
0,0714 |
По локусу INRA005 выявлено 4 аллели длиной от 91 до 100 п.н., отличающихся друг от
друга на 3 п.н. Наибольшая частота встречаемости отмечена для аллельных
вариантов 91
(0,1558), 94 (0,1276), 98 (0,1326). Также относительно чаще встречается аллель 100 (0,11).
При анализе
коров аулиекольской породы изучаемой по локусу BM 2113
выявлено только 3 аллельных варианта длиной от 120 до 127п.н. Наиболее часто
обнаруживается аллель 120 (0,1583),124 (0,1209) и 127 (0,1259). Реже встречается аллель 131
(0,0534).
Локус INRA063 представлен 2 аллельными вариантами длиной от 166 до 170 п.н.
Относительно часто обнаруживаются аллели 166 (0,1445), 170 (0,1529).
По локусу ETH225 нами
выявлено 4 аллельных варианта. Выявлены аллели 194 (0,0721), 190 (0,0684). С частотами 0,0520 и
0,0663 встречаются аллели 192 и 196.
При
исследование полиморфизма локуса OCAM выявлено 4 аллеля с минимальным и
максимальным размером 230 и 224 п.н. Наибольшая частота встречаемости
характерна для аллельного варианта 224 (0,0758). С частотой 0,0595 встречается аллельный вариант 235. Относительно реже встречается аллель
227 (0,0440) и 230 (0,0391).
В локусе HEL13 представлено 3 аллельных варианта длиной от 238 до 242 п.н. Причем,
частота встречаемости аллельного варианта 238 (0,0756)и240 (0,0875) значительно превышает аналогичные значения других
аллелей. Реже обнаруживаются аллель 242 с частотой (0,0454).
При
амплификационном анализе по локусу CSSM66 выявлено 6 аллелей.
Наибольшее и наименьшее значения исследуемого локуса составили 210 и 218 п.н.
Наибольшая частота встречаемости, равная 0,0571, выявлена у аллельного варианта 210. Относительно часто обнаруживаются
аллели 212 (0,0518) и
208 (0,0480). Реже
встречаются аллели 204 с частотой (0,2450), 214 (0,0373) и аллель 218 с частотой (0,0183).
Полиморфизм
локуса ETH10 представлен 3 аллельными вариантами длиной от 111 до 117 п.н.
Наиболее часто встречается аллель 111 (1,4545). С частотой 0,0854 встречается аллельный вариант 117. Реже обнаруживается аллель 115 с
частотой встречаемости 0,2086
Локус BM1818 представлен 3 аллельными вариантами. Наибольшая частота
встречаемости, равная 0,725 выявлена у аллельного варианта
248. Часто обнаруживаются аллели 250 (0,056) и 252 с частотой встречаемости (0,0714).
При амплификационном анализе локуса INRA023 выявлено
5 аллельных вариантов с размером от 133-145 н.п. Самая большая частота
встречаемости характерна для аллельных вариантов 133 (0,0977) и 145 (0,0965). Достаточно часто обнаруживаются
аллели 142 с частотой встречаемости (0,0704). Реже обнаруживается аллель 135 (0,0592) и
138 (0,0362).Размер аллей
составляет от 133 до 145н.п.
При
исследование полиморфизма BM1818 выявлено 6 аллельных варианта. Чаще
встречаются аллельные варианты 175 (0,0742) и 179 (0,0614).
С частотой 0,0508 встречается аллель 177. С частотой 0,0437, встречается
аллель 183 и 0,0508 179 аллель. Относительно
реже встречается аллельный вариант 180 (0,0277) и 185 (0,0216).
У всех
исследованных животных аулиекольской породы после проведения ПЦР с праймерами к
локусу CSSM66 удалось визуализировать и оценить аллельные варианты
последовательностей ДНК. В локусе CSSM66 выявлено 7
аллелей. Наибольшее и наименьшее значения исследуемого локуса составили 139 и
157п.н. Наибольшая частота встречаемости, равная 0,0863, выявлена у аллельного
варианта 139. Относительно часто обнаруживаются аллели 146 (0,0753) и 153
(0,0653). С частотой 0.0653 встречается аллельный вариант 149. Реже встречаются
аллели 141 (0,0212), 145 (0,0344) аллель 157 (0,0127).
Таким образом, в результате генотипирования
коров аулиекольской породы с использованием 12 микросателлитных маркеров
обнаружено 47 аллелей у аулиекольской породы. У крупного рогатого скота аулиекольской породы
выявлено:4 аллельных варианта локуса TGLA 227; 3 -ВМ 2113; 4 - ETH 10; 3
- SPS115;6 – INRA23; 3 –ETH3; 3 - ВМ
1818;4-ВМ 3413; 4- ETH 225; 2 –CSSM66; 6 – INRA063;
5 – INRA005.
Данные, характеризующие полиморфизм 12
микросателлитных локусов ДНК крупного рогатого скота казахской белоголовой
породы представлены в таблице 3.
Таблица 3 – Результаты анализа 12
микросателлитов ДНК КРС казахской белоголовой породы
|
Наименование локуса |
Аллель |
Количество исследуемых
голов КРС |
Ожидаемая
гетерозиготность |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
|
INRA005 |
98 |
6 |
0,0612 |
|
100 |
10 |
0,1 |
|
|
103 |
9 |
0,0873 |
|
|
106 |
16 |
0,1509 |
|
|
109 |
9 |
0,0825 |
|
|
BM2113 |
135 |
24 |
0,1777 |
|
137 |
26 |
0,1897 |
|
|
INRA063 |
190 |
5 |
0,0263 |
|
194 |
13 |
0,0670 |
|
|
198 |
8 |
0,0404 |
|
|
201 |
10 |
0,0497 |
|
|
204 |
6 |
0,0294 |
|
|
206 |
8 |
0,0388 |
|
|
ETH225 |
224 |
16 |
0,0714 |
|
|
228 |
9 |
0,0394 |
|
231 |
15 |
0,0649 |
|
|
235 |
10 |
0,0425 |
|
OCAM |
239 |
16 |
0,0130 |
|
241 |
12 |
0,0497 |
|
|
245 |
22 |
0,0897 |
|
|
HEL13 |
115 |
9 |
0,0762 |
|
118 |
17 |
0,1440 |
|
|
121 |
8 |
0,0661 |
|
|
125 |
16 |
0,128 |
|
|
CSSM66 |
149 |
10 |
0,0671 |
|
150 |
12 |
0,08 |
|
|
153 |
7 |
0,0457 |
|
|
155 |
21 |
0,1354 |
|
|
ETH10 |
210 |
13 |
0,0619 |
|
213 |
15 |
0,0704 |
|
|
215 |
17 |
0,0790 |
|
|
218 |
5 |
0,0229 |
|
|
INRA023 |
135 |
28 |
0,2074 |
|
137 |
22 |
0,1605 |
|
|
SPS115 |
247 |
19 |
0,0769 |
|
250 |
14 |
0,056 |
|
|
252 |
17 |
0,0674 |
|
|
BM1818 |
178 |
15 |
0,0842 |
|
180 |
21 |
0,1166 |
|
|
183 |
14 |
0,0765 |
По локусу INRA005 выявлено 3 аллельных варианта длиной от 98 до 109 п.н. Наибольшая
частота встречаемости отмечена для аллельных вариантов 100 (0,1), 106 (0,1509), 103 (0,0873) и 109 (0,0825). Немного реже встречается аллель 98(0,0612).
При анализе
коров казахской белоголовой породы изучаемой по локусу BM 2113
выявлено только 2 аллельных варианта длиной от 135 до 137п.н. Наиболее часто
обнаруживается аллель 135 (0,1777),
137 (0,1897).
Локус СSSM66 представлен
4 аллельными вариантами. Относительно часто обнаруживаются аллели 1568 (0,1071), 170 (0,0764). С частотой 0,0568 встречается аллель 176. Реже
встречается аллель 174 (0,0517).
По локусу INRA063 нами
выявлено 6 аллельных вариантов. Наиболее часто встречается аллель 197 с
частотой 0,0670.
Выявлены аллели 198 (0,0404), 201 (0,0497). С частотой 0,0388
встречаются аллель 206. Реже встречаются аллели 190 (0,0263) и 204 (0,0294).
При
исследование полиморфизма локуса ETH225 выявлено 4 аллеля с минимальным и
максимальным размером 228 и 224 п.н. Наибольшая частота встречаемости
характерна для аллельного варианта 224 (0,0714). С частотой 0,0649 встречается аллельный вариант 231. Относительно реже встречаются аллели
228(0,0394) и 235 (0,0425).
В локусе OCAM представлено 3 аллельных варианта длиной от 239 до 245 п.н.
Обнаруживается аллель 245 с частотой (0,0897). Относительно часто
обнаруживается аллель 241(0,0497). Реже обнаруживаются аллель 239 с частотой (0,0130).
При
амплификационном анализе по локусу INRA23 выявлено 4 аллели.
Наибольшее и наименьшее значения исследуемого локуса составили 215 и 218 п.н.
Наибольшая частота встречаемости, равная 0,0790, выявлена у аллельного варианта 215. Относительно часто обнаруживаются
аллели 213 (0,0704) и
210 (0,0619). Реже встречаются аллели 218 с частотой (0,0229).
Полиморфизм
локуса ETH3 представлен 4 аллельными вариантами длиной от 115 до 125 п.н.
Наиболее часто встречается аллель 118(0,1440) и 125 (0,128). С частотой 0,0762встречается аллельный вариант 115.
Реже обнаруживается аллель 121 с частотой встречаемости 0,066.
Локус BM1818 представлен 3 аллельными вариантами. Наибольшая частота
встречаемости, равная 0,0769, выявлена у аллельного варианта
247. Часто обнаруживаются аллели 250 (0,056) и 252 (0,0674).
При амплификационном анализе локусаINRA005 выявлено 2аллельных варианта с размером от 135-137. Самая большая
частота встречаемости характерна для аллельных вариантов 137 (0,1605). С частотой 0,2074 встречается аллель 135.
При
исследование полиморфизма INRA063 выявлено 3 аллельных варианта. Чаще
встречаются аллельные варианты 180 (0,1166) и 178 (0,0842).
С частотой 0,0765
встречается аллель 183.
У всех
исследованных животных казахской белоголовой породы после проведения ПЦР с
праймерами к локусу CSSM66 удалось визуализировать и оценить аллельные варианты
последовательностей ДНК. В локусе CSSM66 выявлено 4 аллели.
Наибольшее и наименьшее значения исследуемого локуса составили 155 и 153 п.н.
Наибольшая частота встречаемости, равная 0,1354, выявлена у аллельного варианта 155. Относительно часто обнаруживаются
аллели 190 (0,0671) и
150 (0,08). С частотой
0,0457 встречается аллельный вариант 153.
Таким образом, в результате генотипирования
коров казахской белоголовой породы с использованием 12 микросателлитных
маркеров обнаружено 44 аллелей у казахской белоголовой породы. У крупного рогатого скота казахской
белоголовой породы выявлено:
5 аллельных вариантов локуса INRA005; 2-ВМ 2113; 4 -OCAM;
3- HEL13; 4 – INRA23;
4 –SPS115; 3 - ВМ 1818; 6 – ВМ
3413; 4- ETH 225; 4 –CSSM66; 3 – INRA063;
2 – INRA005.
Выводы
Таким образом, в результате проделанной работы были
про генотипированы 2 породы отечественной селекции по 12 микросателлитным
маркерам, по полученным результатом были обнаружены индивидуальные различия, что
позволяет использовать полиморфизм микросателлитных локусов для генетической
паспортизации животных и оценки достоверности их происхождения.
Литература
1.
Микросателлиты
- маркеры локусов хозяйственно-полезных признаков крупного рогатого скота. Шмидт
Т.Ю., Шевченко В.Г. // Сб. науч. тр. / ВНИИФБиП. - 2000. - Т. 39. - С. 81.
2.
ДНК-
диагностика в селекции крупного рогатого скота. Е.К.Хлесткина // Вавиловский
журнал генетики и селекции – 2013. – Т.17. – С. 1044.
3.
Использование метода ПЦР для генотипирования
крупного рогатого скота по гену CAPN1с использованием генетических маркеров. Д.Б.Косян, Л.Г. Сурундаева, Л.А. Маевская, Е.А. Русакова. // ВЕСТНИК ОГУ – 2012. - Т.6. – С.142
4. Vilkki H.J., Koning D.J., Elo K. et al.
Multiple marker mapping of quantitative trait loci of Finnish dairy cattle by
regression. J. Dairy Sci., 1997, 80, 1: 198-204.
5. Williams J., Usha A.P., Urquhart B.G.,
Kirloy M. Verification of identify of bovine semen using DNA microsatellite
markers. Vet. Rec. 1997, 140: 446-449
6. Genetic
diversity among Indian Gir, Deoni and Kankrej cattle breeds based on
microsatellite markers/ D.S. Kale, D.N. Rank, C.G. Joshi, B.R. Yadav//Karnal. –
2006. - №3, - PP. 128-131.
7. A set of cattle microsatellite DNA markers for genome analysis of riverine
buffalo (Bubalus bubalis)/N. Navani, P. K. Jain, S. Gupta, B. S. Sisodia and S.
Kumar National Bureau of Animal Genetic Resources, Karnal, India. Genome
Research Group, Centre for Cellular and Molecular Biology, Hyderabad, India.//
8. Genetic
variability of 10 microsatellite markers in the characterization of Brazilian
Nellore cattle (Bos indicus). Marcelo CerviniI; Flávio Henrique-SilvaII;
Norma MortariI; Euclides Matheucci Jr. // Genet. Mol. Biol. vol.29 no.3
São Paulo 2006.- PP.
9. Genetic variability of the zebu cattle breed (Bos indicus) in the
department of huila, Colombia using microsatellite molecular markers. Carlos
Hernandez Escobar, Martha Olivera,
Henry Ostos Alfonso, Maria Teresa Guerra //
Acta biol. Colomb.
vol.14 no.3 Bogotá Sep./Dec. 2009.- PP