Гарбар С. А., Романова Л.В., Кузьмина О.Н., Балпанов Д.С.

Филиал РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан», КН МОН РК в г. Степногорск, e-mail: ipbncbrk@mail.ru

СЕЛЕКЦИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ НА ИХ ОСНОВЕ БИОПРЕПАРАТА

В разработке новых пробиотических препаратов наиболее важным является выбор штамма-продуцента, который должен обладать целым рядом признаков, основными из которых являются антагонистические свойства по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, антибиотикорезистентность и безвредность. Эти характеристики должны дополняться определенными физиолого-биохимическими и культуральными свойствами, обеспечивающими высокую конкурентоспособность штамма в организме хозяина и технологичность.

Традиционно в качестве пробиотических микроорганизмов рассматриваются лактобациллы, которые являются важным компонентом резидентской микрофлоры человека и животных, обладают высокой биологической и функциональной активностью, что определяет их практическое использование в качестве пробиотиков и в производстве пищевых продуктов [1]. Бактерии рода Lactobacillus оказывают иммуномодулирующее, противоопухолевое действие, снижают содержание холестерина, синтезируют витамины и другие биологически активные субстанции [2].

Ацидофильные бактерии в виде монокультур или в комплексе с бифидобактериями вводят в состав биологически активных препаратов и пищевых добавок, а также многочисленных молочнокислых продуктов моновидового или комбинированного состава [3].

Таким образом, бактерии Lactobacillus acidopilus представляют большой интерес как объект изучения для разработки пробиотических препаратов.

Целью настоящей работы была селекция штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus с целью создания на его основе пробиотического препарата.

Материалы и методы исследований

В качестве объекта исследований были использованы молочнокислые бактерии Lactobacillus acidophilus (10 штаммов) из рабочей коллекции микроорганизмов биотехнологического центра Института микробиологии
НАН Беларуси.

Количество жизнеспособных клеток бактерий Lactobacillus acidophilus в 1 мл суспензии (число колониеобразующих единиц – КОЕ) определяли методом предельных разведений. Для исследования использовали общепринятые методы и питательные среды на основе восстановленного обезжиренного молока пп. 3.3.3., 4.2.2., 5.2.2. ГОСТ 10444.11-89 [4].

Концентрацию водородных ионов (рН) определяли потенциометрически по ГОСТ 29188.2-91 (п.3.3) [5].

Определение активности кислотообразования (по Тернеру) лактобацилл проводили титриметрическим методом по ГОСТ 3624-92 [6].

Антагонистическая активность штаммов определялась тремя методами:
1) культивирование тест-организмов с нейтрализованными бесклеточными фильтратами (с целью исключения бактерицидного действия молочной кислоты); 2) смешанное культивирование штамма-антагониста и тест-штаммов в тиогликолевой среде; 3) заливка культуры или фильтрата в бороздки, прорезанные в агаре, смешанном с тест-штаммами. В качестве тест-организмов использовали типовые культуры энтеробактерий и псевдомонад.

Устойчивость молочнокислых бактерий к различным концентрациям антибиотических веществ определяли путем внесения их в питательную среду перед посевом. Отсутствие изменений в динамике роста бактерий означало их устойчивость к исследуемым веществам.

Оптимизацию состава питательной среды и условий роста бактерий Lactobacillus acidophilus осуществляли методом глубинного культивирования с использованием питательных сред различного состава:

- среда №1: восстановленное молоко (сухое обезжиренное молоко в количестве 8-10 % от объема среды растворяли в теплой воде (40-50 ⁰С), рН = 6,2-6,6;

- среда №2: меласса – 2 %, кукурузный экстракт – 1,5 %, автолизат пивных дрожжей – 1,0 %, рН = 6,2-6,6;

- среда №3 (MRS): - дрожжевой экстракт – 0,5 %; мясной экстракт – 1,0 %; крахмал растворимый – 0,5 %; пептон – 1,0 %; глюкоза – 2,0 %; лимоннокислый аммоний – 0,2 %; натрий уксуснокислый – 0,5 %; твин-80 – 0,1 %; K₂HPO₄ – 0,2 %; MgSO₄ x 4H₂O – 0,005 %. рН = 6,2-6,6.

- среда №4: восстановленное молоко с добавлением автолизата пивных дрожжей в количестве 1% от объема питательной среды, рН = 6,2-6,6.

- среда №5 – восстановленная сыворотка (сухую сыворотку в количестве 8-10 % от объема среды растворяли в теплой воде (40–50 ⁰С), рН = 6,2-6,6.

В качестве основной (контрольной) питательной среды использовали стандартную среду MRS (среда №3) для выращивания молочнокислых бактерий. Культивирование проводили периодическим способом при температуре (30±2) ⁰С, аэрация и перемешивание отсутствовали.

Морфологию молочнокислых бактерий изучали на препаратах живых и фиксированных окрашенных клеток с использованием световой микроскопии.

Присутствие посторонней микрофлоры определяли путем высева на мясо-пептонный агар (МПА), сусло-агар (СА).

Результаты исследований и их анализ

Первичный отбор вели по продолжительности образования слизистого плотного сгустка в молочной среде при температуре 30 ⁰С. Отмечено, что из 10 исследуемых культур только 2 вызывали свертывание молока в первых трех разведениях в течение первых суток, 1 культура – на вторые сутки, 1 культура – на четвертые и 6 культур – на третьи сутки роста (таблица 1).

Таблица 1 - Динамика роста различных штаммов молочнокислых бактерий

Штамм Lactobacillus acidophilus №	Свертывание молока, сутки
	1	2	3	4
1	-	-	+	+
2	-	-	+	+
3	-	-	+	+
4	-	-	+	+
5	+	+	+	+
6	+	+	+	+
7	-	+	+	+
8	-	-	-	+
9	-	-	+	+
10	-	-	+	+

У трех отобранных быстрорастущих культур (№5, №6, №7) была исследована динамика роста в течение 42 часов, что позволило установить формирование плотного слизистого сгустка в молочной среде культурой №5 уже в течение первых 6-8 часов роста (таблица 2).

Таблица 2 - Динамика роста различных штаммов молочнокислых бактерий

Штамм L. acidophilus №	Свертывание молока, ч
	6	12	18	24	30	36	42
5	+	+	+	+	+	+	+
6	-	-	-	+	+	+	+
7	-	-	-	-	-	+	+

Культура №6 вызывала сквашивание молока в течение 20-24 часов, культура №7 – в течение 36-38 часов. Обе культуры образовывали менее плотный сгусток.

Таблица 3 – Динамика накопления КОЕ у различных штаммов лактобацилл

Штамм L. acidophilus №	Титр жизнеспособных клеток, сутки
	1	2	3	4	5
5	10^3- 10^4	10^7– 10^8	10^10	10^10	10^10
6	10^2	10^8	10^9	10^10	10^10
7	-	10^2	10^4	10^8	10^10

Исследование активности кислотообразования у отобранных штаммов показало, что максимальное значение этого показателя во всех случаях составляет 380-400 ⁰Т и является характерным для активных штаммов Lactobacillus acidophilus.

Таблица 4 - Кислотообразующая активность исследуемых штаммов

Штамм Lactobacillus acidophilus №	Кислотность, ^0Т
	2 суток	7 суток
5	120 - 170	350 - 400
6	150 - 200	380 - 400
7	160	350

По итогам проведенных исследований был отобран штамм лактобацилл №5, характеризующийся высокой скоростью роста, достижением титра жизнеспособных клеток 10¹⁰ в течение 24 часов, активным кислотообразованием и способностью к синтезу значительных количеств полисахаридов. Установлено, что штамм №5 устойчив к оксациллину, хлорамфениколу, слабо чувствителен к цефаклору, норфоксацину, колистину и полимиксину, проявляет выраженный антагонизм по отношению к энтеробактериям и псевдомонадам. Указанные свойства позволяют рассматривать его в качестве перспективного продуцента – основы пробиотиков.

Для отобранного штамма №5 была проведена оптимизация состава питательной среды и условий культивирования.

На первом этапе работы определяли активность роста продуцента на различных средах в течение 48 часов. Экспериментальные данные показали, что максимальное накопление жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) отмечалось на средах с восстановленным молоком при культивировании в течение 24 часов.

В тоже время, ростовые показатели на богатых поликомпонентных средах (контроль и среда №2) и на молочной сыворотке были невысокими и накопление жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) наблюдалось в течение 48 часов (таблица 5).

Таблица 5 – Рост L.acidophilus в зависимости от состава питательной среды

Питательная среда	КОЕ/мл
	24 часа	48 часов
№1	10^10	10^10
№2	10^6	10^7
№3	10^6	10^7
№4	10^10	10^10
№5	10^7	10^7

Как следует из таблицы 5, оптимальными питательными средами для выращивания исследуемых бактерий являлись восстановленное молоко и восстановленное молоко с добавлением автолизата пивных дрожжей.

Следующий этап работы, связанный с изучением стабильности при хранении, проводился с молочнокислыми бактериями, выращенными на указанных выше средах. Исходное значение титра (КОЕ/мл) определяли у 2-суточной культуры, выращенной при температуре 30 ⁰С на различных средах.

Как показали полученные результаты, в процессе хранения количество жизнеспособных молочнокислых бактерий снижалось на 2–3 порядка независимо от исходной величины этого показателя. Наилучшие результаты были получены при выращивании бактерий и их хранении на средах №1 и №4. В данном случае титр КОЕ/мл в течение первого месяца хранения падал только на порядок и стабилизировался на этом уровне в течение последующих 3-х месяцев хранения. Учитывая полученные результаты, изучение влияния температуры на сохранность бактерий продолжили с культурой, полученной на средах №1 и № 4.

Как показано в таблице 6, повышение температуры хранения до (18±2) ⁰С вызывало ежемесячное снижение титра на 10², который в конце хранения (4 месяца) стабилизировался на уровне 10⁴ КОЕ/мл при использовании среды №1 на основе восстановленного обезжиренного молока. Добавление в среду автолизата пивных дрожжей приводило к резкому снижению в процессе хранения количества жизнеспособных клеток продуцента, которое уже через 3 месяца хранения составило 10² КОЕ/мл. Падение титра клеток во всех экспериментах сопровождалось снижением рН. Наиболее значительное снижение рН среды отмечалось при повышении температуры хранения.

Хранение продуцента при температуре (13±2) ⁰С позволяло сохранить высокий титр КОЕ/мл в течение 3-х месяцев на среде с восстановленным молоком и 1-го месяца на среде с добавлением автолизата пивных дрожжей (таблица 6).

Таблица 6 – Влияние температуры хранения на стабильность штамма L. acidophilus

Срок хранения, сутки	Среда №1						Среда №4
	4^0С		15^0С		20^0С		4^0С		15 ^0С		20^0С
	КОЕ /мл	рН± 0,2	КОЕ/мл	рН±0,2	КОЕ/мл	рН±0,2	КОЕ/ мл	рН±0,2	КОЕ/мл	рН±0,2	КОЕ/мл	рН±0,2
2	10^10	4,0	10^10	3,9	10^10	3,9	10^10	4,0	10^10	4,1	10^10	4,0
30	10^9	3,7	10^8	3,7	10^8	3,3	10^9	3,8	10^8	4,0	10^8	4,0
60	10^9	3,3	10^8	3,4	10^6	3,0	10^9	3,6	10^5	3,1	10^4	2,8
90	10^7	3,1	10^7	3,4	10^4	2,9	10^9	3,3	10^4	2,7	10^2	2,6
120	10^7	3,0	10^6	3,1	10^4	2,8	10^9	3,3	10^2	2,7	10^2	2,6

Таким образом, полученные результаты позволяют рекомендовать для выращивания исследуемого штамма молочнокислых бактерий производственную среду на основе восстановленного обезжиренного молока, которая позволяет получить максимальное количество жизнеспособных клеток при культивировании 24 часа и обеспечить гарантированный срок хранения в достаточно широком диапазоне температур (4–15 ⁰С).

Заключение

В результате проведенных исследований:

- отобран штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus, перспективный для использования в составе пробиотиков;

- оптимизирован состав питательной среды и условия культивирования;

- определены условия и сроки хранения жидкой культуры.

Литература:

1. Панин, А.Н. Пробиотики – неотъемлемый компонент рационального кормления животных / А.Н. Панин, Н.И. Малик // ФГУ ВГНКИ: Ветеринария, № 7/2002; Санкт–Петербург, 2002. – С. 12.

2. Глушанова Н.А. Биологические свойства лактобацилл // Бюллетень сибирской медицины. – 2003. – №4. – С. 50-58.

3. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М.: Грантъ. - 2002. - 296 с.

4. Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов: ГОСТ 10444.11-89.

5. Изделия косметические. Метод определения водородного показателя, рН: ГОСТ 29188.2-91.

6. Молоко и молочные продукты. Общие методы анализа: ГОСТ 3624-92.