Жусупов С.И., Балпанов Д.С.

Филиал РГП «Национальный центр биотехнологий», Казахстан

Влияние условий культивирования на рост и антагонистическую активность Bacillus licheniformis 356.

Проблема профилактики и лечения желудочно-кишечной патологий у животных и птицы, возбудителями которых являются условно-патогенные кишечные микроорганизмы, имеет экономическое и социальное значение [1]. Предотвратить развитие многих патологий у животных позволяет использование кормов, обогащенных биологически активными пробиотическими добавками [2-5].

Цель настоящей работы заключается в подборе условий глубинного культивирования штамма Bac. licheniformis 356 входящего в состав разработанной нами пробиотической кормовой добавки для животноводства Пробио-Спорин.

Объектом исследования являлся Bacillus licheniformis штамм 356 – продуцент бацитрацина. Для глубинного культивирования штамма использовали среду с соевой мукой, г/л: мука соевая – 25,0; крахмал картофельный – 20,0; магний сернокислый – 3,0; вода водопроводная до 1 л. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл на термостатируемом роторном шейкере при 240 об/мин, 37 °С.

Для максимального биосинтеза антибиотика изучены различные условия культивирования, такие как рН, температура и аэрация. Для определения влияния начального рН ферментационной среды рН варьировали от значений 5,0 до 9,0. Для определения влияния температуры инкубирование проводили при 30-45 °C. Изучение влияния интенсивности аэрации оценивали с помощью объемного коэффициента массопередачи кислорода (K_La). Объемный коэффициент массопередачи кислорода определяли сульфитным методом [6] варьируя объем среды в колбе и интенсивность перемешивания. Для определения влияния массообменных режимов культивирования на выход целевого продукта использовали квазидинамическую модель [7] периодического процесса культивирования.

Антибиотическую активность культуральной жидкости определяли методом диффузии в агар. Для этого чашки Петри заливали двумя слоями агара (10 мл 2 % агара и 10 мл МПА зараженный тест культурой Micrococcus luteus (ATCC 10240) из расчета 1 млрд. клеток в 1 мл взвеси на 100 мл агара). На агаровой пластинке делали лунки буром диаметром 6 мм. Для приготовления испытуемых растворов в пробирку наливали 9 мл 0,2 Н HCl и 1 мл культуральной жидкости. Время экстракции 20 минут, при перемешивании. Затем содержимое колбы фильтровали через бумажный фильтр. 1 мл полученного фильтрата вносили в мерную колбу объемом 100 мл и доводили объем до метки фосфатным буфером (разведение 1 : 1000). Для получения разведения 1 : 2000 отбирали 2 мл из разведения 1 : 1000 и вносили в пробирку с 2 мл фосфатного буфера. Испытуемые растворы закапывали в лунки, сделанные в агаре с тест-культурой. После инкубации в течение 18 ч измеряли диаметр зон подавления роста.

Для изучения влияния кислотности среды на рост Bac. licheniformis 356, штамм культивировали на средах с соевой мукой с различными исходными значениями рН до полного высыпания спор. Антагонистическую активность определяли после полного высыпания спор. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Влияние рН на титр спор и антагонистическую активность Bac. licheniformis 356.

Исходный рН	Количество спор, КОЕ/мл	Диаметр зон задержки роста тест-культуры, мм
6,0	(1,3±0,11) х 10^9	16,0 ± 1,0
6,5	(2,2±0,17) х 10^9	16,5 ± 1,5
7,0	(2,9±0,21) х 10^9	17,0 ± 1,5
7,5	(2,7±0,19) х 10^9	17,2 ± 1,3
8,0	(1,5±0,14) х10^9	16,0 ± 1,0
8,5	(1,7±0,15) х 10^9	15,0 ± 1,0

Из полученных результатов видно, что максимальный титр клеток и наибольшая антагонистическая активность наблюдается при рН 7,0-7,5. При более высоких и низких значениях рН среды выход титра спор и антагонистическая активность ниже. Полученные результаты согласуются с литературными данными, согласно которым наибольший синтез антибиотиков происходит при нейтральных и слегка щелочных условиях [8].

Влияние температуры на рост и активность штамма Bac. licheniformis 356 оценивали при различных температурах: 30-45 °C. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние температуры на титр спор и антагонистическую активность Bac. licheniformis 356.

Температура роста, °C	Количество спор, КОЕ/мл	Диаметр зон задержки роста тест-культуры, мм
30	(1,7±0,14) х 10^9	14,0 ± 1,0
35	(2,0±0,17) х 10^9	16,5 ± 1,5
37	(2,7±0,22) х 10^9	17,5 ± 1,5
40	(2,5±0,20) х 10^9	17,0 ± 1,5
45	(2,0±0,18) х 10^9	15,5 ± 1,0

Известно, что повышение температуры приводит к некоторому увеличению метаболических процессов, но после некоторого предела, высокая температура препятствует росту микроорганизмов [8]. Штамм Bac. licheniformis 356 показал, что антагонистическая активность оказалась наиболее низкой при температуре культивирования 30°C и повысилась с увеличением температуры до 37 °С. При изменении температуры выше 37 ° С не было никакого значительного увеличения антагонистической активности, а при температуре выше 40 ° С активность резко падает. Оптимальный температурным режим для культивирования Bac. licheniformis 356 – 37 °С.

Антагонистическая активность была наиболее низкой при температуре культивирования 30°C и повысилась с увеличением температуры до 37 °С. Выше 37 ° С не было никакого значительного увеличения антагонистической активности. При изменении температуры выше или ниже 37 ° С резко падает активность. Известно, что повышение температуры приводит к некоторому увеличению метаболических процессов, но после некоторого предела, высокая температура препятствует росту микроорганизмов [8].

Влияние аэрации на рост и антагонистическую активность Bac. licheniformis 356 в колбах объемом 250 мл с различными объемами среды при 240 об/мин. Исследуемые колбы культивировались до полного высыпания спор. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние коэффициента массопередачи кислорода на титр спор и антагонистическую активность Bac. licheniformis 356.

Объем заполнения колб, мл	KLa, ч^-1	Количество спор, КОЕ/мл	Диаметр зон задержки роста тест-культуры, мм
15	280	(4,1±0,33) х 10^9	18,5 ± 1,5
25	156	(3,8±0,27) х 10^9	19,0 ± 1,0
50	63	(1,7±0,15) х 10^9	17,5 ± 1,5
75	32	(1,1±0,07) х 10^9	15,5 ± 1,0
100	17	(1,2±0,09) х 10^9	14,0 ± 1,0

Из данных таблицы 3 видно, что наиболее высокий выход титра спор культуры Bac. licheniformis 356 при величине коэффициента массопередачи кислорода лежащей в интервале 156 и 280 ч^-1. При этих значения наблюдался не только самый высокий выход спор, но и наименьшее время культивирования.

Условия аэрации оказывают большое влияние на рост и биосинтетическую активность Bac. licheniformis [9]. Однако выбор оптимальных условий целесообразно осуществлять с учетом всех фаз роста, так как при периодическом культивировании потребности микроорганизма в кислороде могут быть неодинаковы на разных стадиях развития.

Для идентификации провели серию тестовых опытов, в каждом из которых определенным образом изменяли массообменные профили. Тестовые опыты проводили одновременно на 2-х шейкерах при скоростях вращения роторов, обеспечивающих поддержание верхнего и нижнего значений K_la. Исходя из предыдущего эксперимента за исходный профиль U₀(τ) был взят режим K_la = 200 ч^-1. Интервал варьирования λ = 150 ч^-1. Продолжительность культивирования 48 ч. Результаты тестовых опытов оценивали по росту Bac. licheniformis 356 – таблица 4.

Таблица 4 – Влияние режимов аэрации на рост Bac. licheniformis 356.

№ профиля	Значение Kla на различных стадиях роста				Количество спор, КОЕ/мл
	0-12 ч	12-24 ч	24-36 ч	36-48 ч
1	350 ч^-1	360 ч^-1	360 ч^-1	360 ч^-1	(3,9±0,32)х10^9
2	360 ч^-1	360 ч^-1	60 ч^-1	60 ч^-1	(3,2±0,28)х10^9
3	360 ч^-1	60 ч^-1	60 ч^-1	360 ч^-1	(2,1±0,17)х10^9
4	60 ч^-1	60 ч^-1	60 ч^-1	60 ч^-1	(1,2±0,10)х10^9
5	60 ч^-1	60 ч^-1	360 ч^-1	360 ч^-1	(4,3±0,36)х10^9
6	60 ч^-1	360 ч^-1	360 ч^-1	60 ч^-1	(5,1±0,42)х10^9
Коэффициент чувствительности B (τ)	- 0,97 х 10^-4	3,19 х 10^-4	4,73 х 10^-4	0,56 х 10^-4	I средн. = 3,3 х 10^9

Как видно из таблицы 4 на разных фазах роста культуры Bac. licheniformis 356 требуется различная интенсивность аэрации. Интенсивная аэрация на стадии лаг-фазы и начале фазы экспонинцального роста (0-12 ч роста) незначительно ингибировали рост, о чем свидетельствует отрицательное значение коэффициента B (τ). Максимальный уровень аэрации необходим в период перехода культуры в стационарную фазу и начало спорообразования (24-36 ч роста), несколько ниже потребность в кислороде при экспоненциальной стадии роста (12-24 ч роста). Рост культуры с 12 ч до 36 ч наиболее чувствителен к аэрации. После 36 ч потребность культуры в кислороде резко снижается.

Используя, полученные значения функции чувствительности для различных стадий роста, рассчитаны оптимизационные профили культивирования. Рассчитанные профили при максимальном количестве опытов К = 3 представлены в таблице 5.

Таблица 5 – Оптимизационные профили массопередачи по кислороду при культивировании Bac. licheniformis 356.

Профиль	Значение Kla на различных стадиях роста				Количество спор, КОЕ/мл
	0-12 ч	12-24 ч	24-36 ч	36-48 ч
0	200 ч^-1	200 ч^-1	200 ч^-1	200 ч^-1	(3,9±0,32) х 10^9
1	180 ч^-1	270 ч^-1	300 ч^-1	210 ч^-1	(5,6±0,37) х 10^9
2	140 ч^-1	340 ч^-1	400 ч^-1	220 ч^-1	(4,7±0,44) х 10^9
3	120 ч^-1	410 ч^-1	500 ч^-1	230 ч^-1	(3,4±0,26) х 10^9

Проведенные эксперименты в соответствии с рассчитанными режимами аэрации (профили 1-3) показали, что наилучшими были профили аэрации 1 и 2, где выход титра спор, по сравнению с постоянным режимом культивирования, был, соответственно, на 43,5 % и 20,5 % выше.

Таким образом, представленные данные показывают возможность интенсификации процесса культивирования штамма Bac. licheniformis 356 путем подбора оптимальных условий культивирования. Наиболее оптимальными режимами культивирования являются рН в интервале 7,0-7,5; температура 37 °С. Оптимальная значение K_La, варьирует на разных стадиях культивирования от 180 ч^-1 до 300 ч^-1.

Полученные результаты позволяют усовершенствовать стадию глубинного культивирования штамма Bac. licheniformis 356 в технологии получения пробиотической кормовой добавки для животноводства Пробио-Спорин.

Литература:

1. Кислюк С.М., Новикова Н.И., Лаптев Г.Ю. Целлобактерин-многофункциональная кормовая добавка // Свиноводство. – 2004. – №3. – С. 34.

2. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus / Л.Ф. Бакулина, Н.Г. Перминова, И.В. Тимофеев, А.Ф. Полушкина, Н.И. Печоркина // Биотехнология. – 2001. – № 2. – С. 48-56.

3. Башкиров О.Г. «Биоплюс 2Б» в современном высокоэффективном птицеводстве // Био. – 2002. – №11. – С. 6-8.

4 Грузина В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий // Антибиотики и химиотерапия. –2003. – Т. 48. – №10. – С. 32-39.

5. В.Д. Похиленко, В.В. Перелыгин. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность // Химическая и биологическая безопасность. – 2007. – № 2-3. – С. 32–33.

6. Linek V., Vacek V. Chemical Engineering Use of Catalyzed Sulphite Oxidation Kinetics for the Determination of Mass Transfer Characteristics of Gas-Liquid Contactors // Chemical Engineering Science. 1981. – 36. – P. 1747-1768.

7. Лаврикова В.В., Ириков В.А., Юдина Т.Г., Крашенинникова Т.К., Кантере В.М. Оптимизация условий аэрации в процессе культивирования Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki шт. Z-52 с использованием интегральной квазидинамической модели // Биотехнология. - 1992. – № 2. – C. 61-66.

8. Cladera-Olivera F., Caron G.R., Brandell A. Bacteriocin production by Bacillus licheniformis strain P40 in cheese whey using response surface methodology // Biochemical Engineering Journal. – 2004. - 21(1). – P. 53-58.

9. M. Nadeem, J.I., Qazi S., Baig. Effect of Aeration and Agitation Rates on Alkaline Protease Production by Bacillus licheniformis UV-9 Mutant // Turkish Journal of Biochemistry – 2009. – 34 (2). – P. 89-96.