Балпанов Д.С.¹, Жусупов С.И.¹, Головнева Н.А.², Рябая Н.Е.², Найденко И.А.², Щетко В.А.², Самарцев А.А.²

¹ Филиал РГП «Национальный центр биотехнологий», Казахстан

² Институт микробиологии НАН Беларуси, Беларусь

Селекция желче- и кислотоустойчивых штаммов пробиотических культур микроорганизмов

В последние годы препараты пробиотики рассматриваются как неотъемлемый компонент фармакологического обеспечения современного промышленного животноводства и птицеводства. Использование в ветеринарной практике пробиотических препаратов позволяет улучшить процессы пищеварения, нормализовать обмен веществ, повысить продуктивность сельскохозяйственных животных, улучшить экономические показатели производства, добиться экологической безопасности продукции [1]. С точки зрения терапевтической эффективности и технологичности наиболее значимыми свойствами штаммов бактерий для включения в состав препаратов пробиотиков являются экологическая принадлежность к физиологическим симбионтам организма-хозяина, устойчивость к физиологическим стрессам желудочно-кишечного тракта, к антимикробным препаратам, высокая адгезивность и антагонистическая активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам [2, 3]. Наиболее полно в ветеринарной практике требованиям безопасности и эффективности отвечают препараты, в состав которых входят микроорганизмы из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза. В настоящее время показано, что молочнокислые и бифидобактерии играют немаловажную роль не только в предупреждении заболеваний, ассоциированных с чрезмерной контаминацией кишечной стенки макроорганизма условно-патогенными бактериями с повышенными вирулентными свойствами, но и в предупреждении транслокации возбудителей токсикоинфекций из кишечника организма-хозяина в его органы и ткани [4, 5].

Лечебно-профилактические свойства пробиотических препаратов обусловлены уникальными физиолого-биохимическими свойствами специально отобранных штаммов молочнокислых и бифидобактерий. В настоящее время общепринятым критерием для селекции производственных штаммов пробиотических микроорганизмов является способность бактерий к выживанию и размножению в условиях кишечного микроокружения, что предполагает устойчивость к низким значениям рН и органическим кислотам, к физиологической концентрации желчи, солей натрия и другим факторам. Адаптация и толерантность к желчному и кислотному стрессам является лимитирующим фактором обитания бактерий в среде кишечника. Кроме того, в присутствии солей желчи наблюдается значительное снижение устойчивости бактерий к ряду антибиотиков и сульфаниламидов широкого спектра действия. Например, в присутствии желчи отмечена повышенная чувствительность бифидобактерий к аминогликозидам, пенициллинам, тетрациклинам, амфениколам, макролидам, ансамицинам, линкозамидам. Признак устойчивости к желчи и солям желчных кислот у бифидобактерий генетически детерминирован [6].

Цель исследования – выделение и селекция желче- и кислотоустойчивых штаммов бактерий с пробиотической активностью, исследование их свойств с целью создания лечебно-профилактического препарата для животноводства.

В качестве культур, перспективных для включения в состав пробиотического препарата, отобраны штаммы бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium, на основе которых проведена селекция желче- и кислотоустойчивых вариантов бактерий. Культивирование бифидо- и молочнокислых бактерий осуществляли в термостате при 37ºС на средах различного состава MRS, Блаурокка, тиогликолевой, казеиново-лактозной с дрожжевым экстрактом (КЛД), в зависимости от целей экспериментов. В качестве посевного материала использовали физиологически активные (инокулят III генерации, 18 час роста) культуры, 2-10 об, %, которых вносили в питательные среды. Культивирование проводили в течение 1-4 суток.

Культивирование на твердых питательных средах проводили в анаэробных условиях, используя систему для создания анаэробной атмосферы «Анаэропак Н₂ +СО₂».

Биомассу бактерий определяли весовым методом, высушивая отмытые клетки до постоянного веса при 105ºС, а также путем измерения оптической плотности суспензии бактерий при 590 нм.

Количество жизнеспособных клеток бактерий в 1 мл суспензии (число колониеобразующих единиц - КОЕ) определяли методом предельных разведений при высеве на питательные среды, содержащие 0,2% агара. Активность кислотообразования - титрометрическим и потенциометрическим методами.

Определение устойчивости к желчи проводили при глубинном культивировании бактерий на среде КЛД, содержащей желчь сгущенную (1, 20 и 40 об. %) или сухую (1-5 %). Устойчивость к желчи определяли по уровню накопления биомассы, изменению числа КОЕ и активной кислотности среды культивирования.

Адаптацию бифидобактерий к желчи проводили методом субкультивирования на среде КЛД, содержащей 1 об.% желчи в течение четырех месяцев, кратность пересевов 2-3 раза в неделю. Для успешной адаптации бифидобактерий к желчи требовалось не менее двух месяцев с условием постоянного отбора устойчивых вариантов культуры. Для полученных вариантов свойство устойчивости к желчи сохраняется при длительном хранении на среде КЛД с 1 об.% желчи в условиях умеренной гипотермии (4-6ºC).

Антагонистическую активность бактерий определяли общепринятыми методами на жидких (метод предельных разведений) и агаризованных (метод диффузии в агар) питательных средах.

Активность α- и β-галактозидаз определяли колориметрически по количеству освободившегося о-нитрофенола из, соответственно, о-нитрофенил-α-D-галактопиранозида и о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида при 37⁰С после 60 мин инкубации.

Проведена селекция штамма бифидобактерий Bifidobacterium sp. по признаку устойчивости к солям желчных кислот и штамма лактобацилл Lactobacillus sp. по уровню кислотоустойчивости.

Показатели желчеустойчивости штамма бифидобактерий приведены в таблице 1. В присутствии желчи в концентрациях 20% и 40% наблюдается незначительный прирост биомассы, снижение показателей активности роста и кислотообразования. Интенсивность накопления биомассы в динамике развития популяций бифидобактерий зависит от концентрации желчи в среде культивирования.

Таблица 1 Исследование устойчивости к желчи культуры Bifidobacterium sp.

Контроль				Концентрация желчи
				20 %			40 %
Время роста, ч	Био-масса, мг/мл	Актив-ность роста, КОЕ/мл	рН	Био-масса, мг/мл	Актив-ность роста, КОЕ/мл	рН	Био-масса, мг/мл	Актив-ность роста, КОЕ/мл	рН
0	0,08	4·10^7	6,6	0,11	2·10^7	6,4	0,108	9·10^6	6,3
24	0,95	2,6·10^10	4,7	0,26	3·10^2	5,9	0,145	0	6,1
48	0,96	1,3·10^9	4,5	0,25	0	5,9	0,145	0	6,1

В результате селекции по признаку активного роста на средах, содержащих желчь, отобран вариант штамма Bifidobacterium sp., характеризующийся активным ростом в присутствие 1 % желчи в среде (таблица 2).

Таблица 2 Показатели роста вариантов культуры бифидобактерий, полученных методом адаптивной селекции на среде КЛД с желчью

Варианты	Активность роста*, КОЕ/мл	Биомасса*, мг/мл
Культуры после трех пассажей на среде КЛД с 1 % желчи	7.4×10^7	0.67
Культура, адаптированная методом субкультивирования на среде КЛД с 1 % желчи в течение 4 месяцев.	1.5×10^10	0.92

*- 24 ч культивирования на среде КЛД с 1 % желчи; средние показатели 3-5 измерений

Полученный штамм обладает не только высокой активностью роста и кислотообразования, но проявляет и ферментативную активность – протеолитическую, α- и β-галактозидазную (рисунок 1).

Рисунок 1 - Показатели роста (1 – биомасса, мг/мл, 2 – удельная скорость роста, μ, ч) и ферментативной активности B. adolescentis В01-12 на среде КЛД при использовании 10% инокулята

В результате адаптивной селекции по признаку кислотоустойчивости получен штамм Lactobacillus sp. Селектированные лактобациллы выдерживают инкубирование при рН 2,1 в течение 2 часов без снижения тира жизнеспособных клеток, характеризуются высокой активностью роста и кислотообразования на средах разного состава, а также продуцируют экзополисахарид (рисунок 2).

.

Рисунок 2 – Накопление биомассы (OD 590), кислотообразование (рН) и содержание полисахарида (ПС) на питательных средах, содержащих разные углеводы

Таким образом, в результате адаптивной селекции получены желчеустойчивый штамм бифидобактерий и кислотоустойчивый штамм молочнокислых бактерий, перспективные для использования в составе лечебно-профилактического препарата для животноводства.

Литература:

1 Малик Н. И., Панин А. И. Ветеринарные пробиотические препараты // Ветеринария. – 2001. – № 1 – С. 46-51.

2 Лесняк С.В. Характеристика производственных штаммов-продуцентов колибактерина, бифидумбактерина и лактобактерина по антагонистической активности, устойчивости к антибиотикам и жизнеспособности / Отчет ГИСК – М.: 1982 – №02820084317. – 28 с.

3 Fujiwara S., Hashiba H., Hirota T. and Forstner J.F. Proteinaceous factor(s) in culture supernatant fluids of bifidobacteria which prevents the binding of enterotoxigenic Escherichia coli to gangliotetraosylceramide // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. – V 63, Nо. 2. – P. 506-512.

4 Lie´vin-Le Moal V., Servin A. L. The front line of enteric host defense against unwelcome intrusion of harmful microorganisms: mucins, antimicrobial peptides, and microbiota // Clinical microbiology reviews – 2006. – V.19, No.2 – P. 315-337.

5 Asahara T., Nomoto K., Shimizu K., Watanuki M., Tanaka R. Increased resistance of mice to Salmonella enterica serovar Typhimurium infection by synbiotic administration of Bifidobacteria and transgalactosylated oligosaccharides // J Appl Microbiol. – 2001. – V.91, Nо.6. – P. 985-996.

6 Ruiz L., Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., de los Reyes-Gavila´n C.G., Margolles A., Sa´nchez B. How do bifidobacteria counteract environmental challenges? Mechanisms involved and physiological consequences// Genes Nutr. –2011. – Nо.6. – P. 307-318.