Береснев А.И.,
Рымко А.Н., Квач С.В., Кузьмина О.Н. Орлова Л.А.,
Романова
Л.В., Зинченко А.И.
Институт микробиологии
НАН Беларуси, г. Минск
Конструирование генно-инженерного
штамма Pichia pastoris, продуцирующего протеиназу К Tritirachium
album
Одним из главных компонентов реакционной смеси при постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР) является ДНК, несущая ген, который необходимо клонировать. Перед внесением в реакционную смесь ДНК, как правило, подвергается тщательной очистке от белковых примесей и других клеточных компонентов. Начальным этапом существующих методов очистки ДНК является лизис клеток, осуществляемый, в большинстве случаев, с использованием протеиназы К Tritirachium album, которая представляет собой сериновую протеазу, катализирующую гидролиз полипептидной цепи в сайтах, содержащих алифатические аминокислоты [1].
Ранее
протеиназу К получали путем культивирования T.
album с последующим выделением целевого фермента из
культуральной жидкости. Недостаток этой технологии заключался в сложности получения
высокоочищенного ферментного препарата протеиназы К, ввиду наличия многих
трудноразделяемых белковых примесей [3].
В настоящее время широкое распространение для экспрессии белков приобретают дрожжи Pichia pastoris. Клетки этого штамма обеспечивают высокий уровень синтеза целевых продуктов, а также малое количество экскретируемых белков, способных как затруднить выделение, так и привести к деградации синтезированные биомолекулы.
Таким образом, целью настоящего исследования явилось конструирование генно-инженерного штамма P. pastoris продуцента рекомбинантной протеиназы К T. album.
Объекты и методы исследования. В работе
использовали штамм T. album F-3028 («Всероссийская коллекция
микроорганизмов», Россия), ДНК
которого содержит ген ppk, кодирующий протеиназу К, и штамм P. pastoris GS115 («Invitrogen», США), необходимый для продукции
этого фермента. С использованием стандартных методик генетической инженерии, а
также с учетом рекомендаций фирмы-изготовителя, на основе ДНК-вектора pPink-HC («Invitrogen», США) создана генетическая конструкция, несущая ген ppk, при помощи которой осуществили трансформацию клеток P. pastoris.
Высокоплотностное (fed-batch) культивирование созданного штамма
проводили в 60-литровом ферментере («Biotron», Корея) с постоянным контролем значения
рН и уровня насыщения кислородом, при 30 °С в среде (20 л), содержащей 18,6 г CaSO4, 364 г K2SO4,
298 г MgSO4×7H2O, 106 г NH4Cl, 800 г глицерина,
32 мг биотина, 0,1 М К-фосфатный буфер (рН 6,0), а также 240 мл смеси
микроэлементов (г/л): 6 г CuSO4×5H2O; 0,08 г NaI, 3
г MnSO4×H2O, 0,2 г Na2MoO4×2H2O,
0,02 г H3BO3, 0,5 г CoCl2, 20 г ZnCl2,
65 г FeSO4×7H2O. После истощения содержавшегося в
среде глицерина начинали проводить одновременное непрерывное внесение 50 %-го
глицерина и 50 %-го метанола по 4,5 мл/мин каждого в течение 6 ч. По истечении
указанного времени осуществляли добавление 50 %-го метанола еще в течение 48 ч со
скоростью 4,5 мл/мин. Значение рН поддерживали на постоянном уровне путем
внесения в среду культивирования 29 %-го аммиака.
Контроль накопления протеиназы К определяли путем измерения
активности фермента в культуральной жидкости (КЖ). За единицу активности
протеиназы К принимали такое ее количество, которое обеспечивало гидролиз 1
мкмоля азаказеина при 37 °С в течение 20 мин. Качественное определение
протеиназы К в КЖ проводили с использованием ДСН-полиакриламидного
гель-электрофореза.
Результаты и
обсуждение. На первом этапе работы на
основе плазмидного вектора pPink-HC создана
генетическая конструкция, несущая ген ppk, кодирующий
протеиназу К. В этом векторе ген находится под контролем AOX1-промотора, обеспечивающего суперэксперессию гена ppk под действием индуктора, в качестве которого выступает
метанол. Кроме того, ген ppk содержит
на 5'-конце нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерный пептид,
ответственный за экскрецию протеиназы К из клетки в КЖ.
Клетки полученного в ходе трансформации созданным вектором
штамма P.
pastoris, продуцирующего протеиназу К, выращивали, используя т.н. fed-batch-культивирование. Данный метод
выращивания микроорганизмов позволил наработать количество дрожжевой биомассы в
несколько десятков раз большее по сравнению с традиционным культивированием – без
постоянного внесения в среду источников углерода.
Уровень кислорода в среде в ходе экспоненциальной фазы
роста клеток дрожжей, а также после ее завершения, поддерживали в диапазоне
50–60 %.
Рисунок 1 – Динамика
накопления протеиназы К в КЖ в ходе
fed-batch-культивирования
Как следует из данных, представленных на рисунке 1, максимальный достигнутый нами выход целевого фермента составил 0,5 г/л. Качественный анализ содержания протеиназы К в КЖ представлен на электрофореграмме (рисунок 2).
29 кДа Рисунок 2 – Электрофореграмма
белкового состава КЖ в ходе fed-batch-культивирования
клеток штамма P. pastoris, продуцирующих рекомбинантную протеиназу К 20 кДа Протеиназа К
Исходя из результатов электрофореграммы, следует отметить, что большинство белков КЖ, кроме целевого фермента, имеют молекулярную массу ниже 20 кДа, что в дальнейшем может значительно облегчить процедуру выделения протеиназы К. Такая масса примесных белков может быть объяснена их способностью подвергаться протеолитическому расщеплению в ходе культивирования под действием протеиназы К.
Заключение. Таким образом, в ходе выполнения работы нами сконструирован генно-инженерный штамм P. pastoris RPTK–1, продуцирующий рекомбинантную протеиназу К, а также проведено fed-batch-культивирование клеток этого штамма, в результате которого конечный выход целевого фермента составил 0,5 г/л.
Литература:
1. Rohland N., Hofreiter M. Comparison and optimization of
ancient DNA extraction // Biotechniques. 2007. Vol. 42. P.
343–352.
2. Ebeling W., Hennrich N., Klockow M. Proteinase K from Tritirachium album Limber // Eur. J.
Biochem. 1974. Vol. 47. P. 91–97.