Булатовский А.Б., Силицкая Е.Н., Ерошевская Л.А., Квач С.В.,

Рымко А.Н., Зинченко А.И.

Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск

Международный государственный экологический университет

им. А.Д. Сахарова, Минск

Создание генно-инженерного штамма-суперпродуцента декстрансахаразы

Декстран (групповое название полисахаридов, основная молекулярная цепь которых состоит из ангидроглюкопиранозных звеньев, соединенных преимущественно α-1,6-гликозидными связями) получают при культивировании микроорганизмов Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Streptobacierium dextranicum и др. в среде, содержащей сахарозу или другие углеводы, в состав которых входят ангидро-О-глюкопиранозные звенья [1, 2].

Декстраны широко используются в качестве заменителя плазмы крови, повышения вязкости растворов в молочной и пищевой промышленности, изготовления сефадекса, используемого в биохимической промышленности.

Синтез декстрана под действием декстрансахаразы происходит путём присоединения глюкозильных остатков к восстанавливающим концам полисахаридных цепей декстрана. Известно, что при культивировании L. mesenteroides на питательной среде, содержащей сахарозу или мелассу в качестве источника углерода и энергии, декстрансахараза в значительной степени выделяется в среду [3]. Однако, получение декстрансахаразы из L. mesenteroides является трудоемким, за счет продукции слабоактивного фермента и сложности культивирования представителей этого вида бактерий. Поэтому для синтеза декстрансахаразы в литературе был предложен ряд штаммов вида L. lactis [4]. Предполагалось, что в клетках этих бактерий синтез фермента идти более эффективно.

Целью настоящего исследования было создание генно-инженерного штамма L. lactis-суперпродуцента декстрансахаразы L. mesenteroides.

Материалы и методы исследования. Клонирование гена ΔdsrD (GenBankID: AY017384.1), кодирующего декстрансахаразу L. mesenteroides, осуществляли методом продолжительной перекрывающейся ПЦР (ПП-ПЦР) [5, 6]. Ген выделяли из ДНК бактерий L. mesenteroides методом ПЦР с использованием «Phusion High-Fidelity»-ДНК-полимеразы («Fermentas», Литва) и двух олигонуклеотидных праймеров («Праймтех», Беларусь): F (5′-GTGGTGGTCCACAACACACAACA-AGTTAGCGGC-3′) и R (5′-GGTGATGGTGATGACTCAAGTTAGTATCTGG-ATC-3′). К 5′-концам праймеров были добавлены нуклеотидные последовательности (выделены подчеркиванием), комплементарные плазмиде pNZ8121 («MoBiTec», Германия). На втором этапе линеаризовали вектор методом ПЦР с использованием «Phusion High-Fidelity»-ДНК-полимеразы и двух олигонуклеотидных праймеров: F (5′-GAGCATCACCATCACCACCACTGATAAAGCAAT-TACTGATATTGC-3′) и R (5′-GTTGTGGACCACCACCGCCTTTGCTTGGAT-3′). На третьем этапе собирали линеаризованный вектор и ген методом ПП-ПЦР по следующей программе: этап предденатурации 2 мин при 95°С; 16 циклов амплификации: 30 с при 95°С, 30 с при 55°С, 4 мин при 72°С; финальная элонгация – 6 мин при 72°С. На этом этапе в качестве матрицы и затравки использовали фрагменты, полученные на первых двух этапах.

Синтезированным с помощью ПП-ПЦР продуктом трансформировали компетентные клетки L. lactis NZ3900 («MoBiTec», Германия), c последующим высевом на плотную питательную среду LB [7], с добавлением хлорамфеникола (10 мкг/мл). Выросшие колонии анализировали на наличие плазмиды со встроенным геном ΔdsrD методом ПЦР. В результате была создана генетическая конструкция, обозначенная pNZ8121ΔdsrD. В данной конструкции имеется сигнальный пептид, который ответственный за экскрецию декстрансахаразы наружу клетки.

Клетки-трансформанты культивировали при 30ºС на среде LB до оптической плотности 0,5 (λ=600 нм), затем проводили индукцию синтеза, путем внесения в среду низина до концентрации 0,5 мг/мл и продолжали культивировать на протяжении 24 ч при 15°С. По окончании выращивания клетки осаждали центрифугированием. В полученном супернатанте определяли активность фермента. При этом, за единицу активности фермента принимали, такое количество, которое обеспечивало образование фруктозы из сахарозы в количестве 1 мкмоль за 1 мин.

Результаты и их обсуждение. Перед нами была поставлена цель ‒ сконструировать новый рекомбинантный штамм-продуцент декстрансахаразы путем клонирования гена декстрансахаразы из L. mesenteroides не в гомологичных клетках, а в клетках геторологичного микроорганизма ‒ L. lactis. Предполагалось, что это позволит увеличить выход фермента, упростит и удешевит культивирование.

На первом этапе работы с помощью методов генетической инженерии [5] была сконструирована плазмида pNZ8121ΔdsrD (рис. 1). Далее ею были трансформированы компетентные клетки L. lactis NZ3900. В итоге был создан штамм-продуцент декстрансахаразы L. lactis pNZ8121ΔdsrD.

~7000 п.о.

М 1

Рис. 1. Электрофореграмма созданной генетической конструкции

М – фрагменты ДНК с известным количеством пар оснований. 1 – конструкция pNZ8121ΔdsrD

На втором этапе полученный штамм выращивали на питательной среде LB до оптической плотности 0,5 (λ=600 нм) с последующей индукцией синтеза белка путем внесения индуктора (низина) до конечной концентрации 0,5 мг/мл. После окончания культивирования (24 ч) клетки осаждали путем центрифугирования и в полученном супернатанте определяли активность экскретированного фермента, уровень экспрессии и чистоту при помощи SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 2). Продуцирующая способность нового рекомбинантного штамма L. lactis pNZ8121ΔdsrD в среднем составила 145 000 ед/л КЖ, что превышает в 3 раза активность известного штамма-прототипа ‒ L. mesenteroides-Lcc4.

1

~160 кДа

М

Рис. 2. Электрофореграмма белкового состава супернатанта с

декстрансахаразой

М – маркерные белки, с известной молекулярной массой. 1 – супернатант

Заключение. В результате выполнения работы был сконструирован штамм L. lactis pNZ8121ΔdsrD, продуцирующий гетерологичную рекомбинантную декстрансахаразу.

Литература:

1. Rosi N.L., Mirkin C.A. Nanostructures in Biodiagnostics // Chem. Rev. 2005. Vol. 105. P. 1547–1562.

2. Wang X. et al. The atmospheric and room-temperature plasma (ARTP) method on the dextranase activity and structure // Int. J. Biol. Macromol. 2014. Vol. 70. P. 284–291.

3. Otts D.R., Day D.F. Dextransucrase secretion in Leuconostoc mesenteroides depends on the presence of a transmembrane proton gradient // J. Bacteriol. 1988. Vol. 170, N 11. P. 5006–5011.

4. Neubauer H., Baucheґl A., Mollet B. Molecular characterization and expression analysis of the dextransucrase DsrD of Leuconostoc mesenteroides Lcc4 in homologous and heterologous Lactococcus lactis cultures // Microbiol. 2003. Vol. 149. P. 973–982.

5. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, P. MacCallum, D. Russell // Cold Spring Harbor Laboratory Press. – 3rd ed. – New York, 2000. – 2222 p.

6. Quan J., Tian J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways // PLoS ONE. 2009. Vol. 4, N 7. e6441.

7. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures // Protein Expr. Purif. 2005. Vol. 41, N 1. P. 207–234.