ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОНЦЕНТРИРОВАННОГО ФИТОПРЕПАРАТА ИЗ
ШЕЛУХИ ЛУКА РЕПЧАТОГО АLLIUM СЕPА С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ГЕТЕРОЦИКЛИЦЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ – ФЛАВАНОИДОВ
Н.К. Жангалиев 1, К. М. Абдрашева 2,
В.В. Поляков 3 доктор химических наук,
профессор,
П.С. Дмитриев 4 кандидат биологических
наук, доцент
1,2 Областная специализированная
гимназия – интернат для одаренных детей им.А.Досмухамбетова,
3,4 Северо-Казахстанский
государственный университет им. М.Козыбаева
Казахстан, Петропавловск
Аннотация: В статье
приводятся результаты экспериментального исследования по приготовлению экологически
чистого фитопрепарата из шелухи лука репчатого (Аllium сеpа).
Представлен исходный химический состав шелухи лука репчатого (Аllium сеpа), уникальная методика приготовления
фитопрепарата из исследуемого обьекта, результаты 5-ти кратного
хроматографического снимка полученного фитопрепарата на выявление биологически
активных веществ. Кроме того, описана возможная практическая значимость данного
препарата в производственной фармацевтике, сельском хозяйстве и в области общей
биологии, биохимии и биофизики.
Ключевые слова: фитопрепарат
из шелухи лука репчатого (Аllium сеpа), методика приготовления препаратов из
сырья растительного происхождения, БАВ, флаваноиды, кверцетин, рутин,
хроматографический анализ, гетероциклические фенольные соединения.
В последние годы внимание многих исследователей
привлекает растительное сырье, содержащее фенольные соединения, в том числе флавоноиды,
что обусловлено их безвредностью и широким спектром биологической активности. Одним
из перспективных растительных источников фенольных соединений является шелуха
лука репчатого (Аllium сеpа), которую более 95% людей
считают непригодной для потребления, так как шелуха лука репчатого входит в ряд
пищевых отходов. Однако, по мнению ученых, в составе шелухи больше биологически
активных веществ, чем в самих ассимилирующих листьях или утолщенных стеблях луковицы,
которые принято употреблять в пищу или же в производстве некоторых медицинских
препаратов и биологически активных
добавок (БАД)
[1,2].
Шелуха лука содержит такие вещества, как: витамины А, Е, С, В1, В2, В3, В5, В6,
В9, аскорбиновая кислота, никотиновая кислота (РР), каротин, флавоноиды кверцетин
и рутин, фитонциды, калий, кальция, сера, натрий, железо, фосфор, хлор, магний,
органические кислоты, эфирные масла, аллил пропил дисульфид, углеводы, целлюлозу, моно- и дисахариды, соединения
кремниевой кислоты и др. [3]. Именно такой
внушительно богатый химический состав нужно будет определить после приготовления
фитопрепарата из исследуемой шелухи лука.
Методика приготовления
концентрированного фитопрепарата из шелухи лука репчатого (Аllium сеpа)
Методика приготовления концентрированного
фитопрепарата из шелухи лука репчатого Аllium
сеpа
(далее просто – препарат) была составлена нами на основе современных данных о
выделении фенольных соединений из экстрактов растительного сырья.
Процесс приготовления фитопрепарата из
луковой шелухи включал в себя несколько этапов, которые в максимальной подробности
описаны ниже:
1. Для приготовления
препарата берется около 300 г промытой проточной водой и высушенной луковой
шелухи;
2. Далее 150 г шелухи
заливается водой в соотношении 1:10 (150 г: 1,5 л воды) и на слабом огне доводится
до кипения в течение 10 минут;
3. Получается отвар
шелухи лука репчатого;
4. Затем отвар процеживается,
остужается на водяной бане и отстаивается в сухом и темном месте в течение 5
часов;
5. После чего добавляется
оставшиеся 150 г измельченной шелухи и 1500 мл воды;
6. Затем отвар повторно
доводится до кипения в течение 25 минут и охлаждается на водяной бане в течение
10 часов, пока все твердые частицы не осядут на дно. Получается экстракт шелухи
лука репчатого;
7. Потом верхняя часть
полученного экстракта аккуратно выливается (меньше половины всего объема) и оставшаяся
часть повторно кипятится на сильном огне, до состояния, пока 50% исходного объема
не испарится. Получается водяной концентрат шелухи лука репчатого;
8. После чего, полученный
концентрат процеживается и повторно охлаждается на водяной бане до комнатной температуры
(24,5°С) и хранится в темном и сухом месте в течение
2 суток. За это время все твердые частицы нерастворенных в воде флавоноидов полностью
оседают на дне емкости, а определенные химические соединения растворяются в
воде окончательно;
9. После 2 дней, верхнюю
часть концентрата (около половины всего объема), в которой концентрация твердых
частиц меньше, аккуратно выливают или же вытягивают с помощью большой пипетки;
10.
Для
того чтобы нерастворимые в воде гетероциклические вещества, такие как кверцетин
и рутин, окончательно растворились, оставшуюся нижнюю часть заливают этиловым спиртом
(70%) или бутанолом (в нашем случае использовался спирт) в соотношении 1:1,2 и
на сильном огне доводят до кипения, при этом следует тщательно перемешивать концентрат.
Концентрат кипятят более 30 минут, до того, пока весь спирт и 30% имеющейся воды
не испарится. Затем следует повторно процедить концентрат и охладить, непосредственно,
на водяной бане. После чего разлить по лабораторным пробиркам цилиндрической формы
с коническим или полукруглым дном;
11.
Затем пробирки помещают в лабораторную центрифугу
(в нашем случае использовалась центрифуга «ОПн-8УХЛ 4.2» из химической лаборатории
СКГУ им. М.Козыбаева). Центрифугирование осуществляется в течение 2 мин при
800g. При этом формируется градиент плотности жидкой среды в направлении сверху
вниз;
12.
Более
плотные химические вещества направляются в периферию по градиенту плотности (за
счет центробежной силы). В конечном итоге, после такого дифференциального центрифугирования
химические вещества в зависимости от их плотности и массы располагаются на разной
высоте пробирки. В верхних слоях расположены, в основном, эфирные масла,
триглицериды (в минимальных количествах) с плотностью 0,9-0,92 г/см3,
далее, соответственно, сверху вниз, расположены аллил пропил дисульфид (основной
фитонцид репчатого лука) с плотностью 0,93-0,96 г/см3, затем вода с
плотностью 0,9982 г/см3, потом другие минеральные вещества, кислоты,
и наконец, флавоноиды кверцетин и рутин с плотностью 1,799 г/см3;
13.
Для
того чтобы разделить воду от растворенных биологически активных веществ, можно
использовать обыкновенный медицинский шприц (10-20мл). Шприцом отделяют всю воду,
расположенную в верхней части. При этом эфирные масла, расположенные на верхних
слоях, предварительно отделяют для того, чтобы после удаления воды добавить их обратно
в смесь биологически активных веществ;
14.
В
пробирке остается густоватая смесь с концентрацией биологически активных веществ
в размере 92,5%. Смеси из всех пробирок соединяют в одной общей емкости, тщательно
перемешивают и дают отстояться не менее 5 дней. Препарат из шелухи лука репчатого
(Аllium сеpа)
окончательно готов к применению [4].
Полученный препарат из шелухи лука репчатого
(Аllium сеpа) – вязкая, высококонцентрированная жидкость коричневого цвета
(иногда между коричневым и оранжевым цветом). Растворим в спирте, ацетоне, эфире,
с водой образует эмульсию. Плотность при 24,5°С –
0,988 г/см3. Массовая доля твердых частиц (в основном, флавоноидов)
– 83 % [4].
В состав полученного препарата входят
эфирные масла, карбоновые и жирные кислоты, полифенолы, фитонциды, углеводы,
микроэлементы, витамины (А, Е, С, Р), флавоноиды, аминокислоты и др. классы
природных соединений, обладающих высокой биологической активностью. В нем отсутствуют
тяжелые металлы и гербициды, фунгициды и все остальные виды пестицидов, а содержание
радионуклидов не превышает минимума [4].
Как было известно ранее, шелуха лука содержит
в себе внушительно большой комплекс БАВ. В ряд таких БАВ входят,
непосредственно, флавоноиды кверцетин и его гликозид – рутин. Из шелухи лука в
процессе исследования был приготовлен препарат, в котором, предположительно, большую
часть занимают растворенные флавоноиды. Для того, что бы доказать это, было решено
провести точную хроматографию препарата на наличие флавоноидов кверцетина и
рутина.
Проведенная нами хроматография по физической
природе подвижной и неподвижной фаз являлась ТЖХ (твердо – жидкофазной хроматографией);
в зависимости от способа перемещения сорбатов вдоль сорбента была - элюентная;
по характеру процесса – планарная; в зависимости от цели проведения являлась аналитической;
по способу движения растворителя – восходящая [5].
Для разделения флавоноидов, хроматографирование
препарата осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках PОLYGRАM® SОRBFIL ПТСХ-П-В в
системе растворителей БУВ – н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5) для флавоноида
кверцетина и в системе растворителей БУВ
- н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:2) для флавоноида рутина в химической лаборатории СКГУ им. М.Козыбаева [6]. Всего было проведено 5 идентичных процессов хроматографирования
препарата.
Условия хроматографирования:
Объем колбы – 0,5 л. Высота колбы – 20 см. Скорость подачи элюента во всех случаях
была равна 100 мкл/мин. Температура внутри колбы - стандартная – 24,5°С, градиент
элюента – 50%.
Этапы хроматографирования:
1. В колбы (5шт.) с
размеров 0,5л и высотой 20 см налили систему растворителей БУВ - н-бутанол – уксусная
кислота – вода (4:1:5) в общем объеме 10мл в каждую.
2. На пластинке PОLYGRАM® SОRBFIL ПТСХ-П-В с помощью
графитного карандаша отметили линию старта (l0) на высоте 0,5 см (всего:
5 пластин).
3. На линию старта
(по центру) каждой пластинки нанесли 5 капель исследуемого препарата. При этом
нужно, что бы каждая капля успела просочиться на поверхности полиамидной пластинки.
Для этого следует соблюдать интервал между нанесением капель (1 минута).
4. После, поместили
пластинки в соответствующие колбы с системой растворителей БУВ и закрыли крышкой
для сохранения стабильности температуры внутри емкости.
5. Через 45 минут
пластинки с препаратом на всех пластинках можно было вытащить и посмотреть (на обычном
свету и на УФ свете).
В каждой хроматограмме был подсчитан Rf
– соотношение расстояния, пройденного веществом (в нашем случае, вещество – это
препарат) и расстояния, пройденного элюентов (система растворителей БУВ). Со всех
отдельных значений Rfn был сложен один
общий Rfобщ (подробно в приложении А) [6].. Кроме значений Rf, так же были описаны
окраски пятен в видимом свете и УФ-свете до обработки реактивом, а также флюоресценция
каждого пятна после обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида.
Полученные данные процесса хроматографирования
препарата сравнивались с рабочими стандартными образцами (РСО) флавоноидных соединений
– кверцетина и рутина, которые тоже были определены методов хроматографии. Результаты
хроматографирования препарата подробно описаны в таблице 1.
Таблица 1.
Хроматографические характеристики препарата и РСО
|
№
пятна |
Rf |
Окраска
пятен в видимом свете |
Окраска
пятен в УФ-свете |
Флюоресценция
после обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида |
Заключение,
% |
|
Хроматограмма
№ 1 |
|||||
|
1 |
0,609 |
желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Рутин
99% |
|
2 |
0,789 |
желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Кверцетин
99% |
|
Хроматограмма
№ 2 |
|||||
|
1 |
0,612 |
желтая |
светло
- коричневая |
желто
- зеленая |
Рутин
97% |
|
2 |
0,791 |
желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Кверцетин
94% |
|
Хроматограмма
№ 3 |
|||||
|
1 |
0,610 |
светло
- желтая |
темно
- желтая |
ярко
- зеленая |
Рутин
91% |
|
2 |
0,789 |
светло
- желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Кверцетин
96% |
|
Хроматограмма
№ 4 |
|||||
|
1 |
0,608 |
светло
- желтая |
темно
- желтая |
салатного
цвета |
Рутин
90% |
|
2 |
0,790 |
светло
- желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Кверцетин
96% |
|
Хроматограмма
№ 5 |
|||||
|
1 |
0,610 |
желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Рутин
98% |
|
2 |
0,790 |
желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Кверцетин
97% |
|
Общий
средний анализ хроматограмм |
|||||
|
1 |
0,6098 |
желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Рутин
100% |
|
2 |
0,7898 |
желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Кверцетин
100% |
|
РСО
рутина |
|||||
|
1 |
0,61 |
желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Рутин
100% |
|
РСО
кверцетина |
|||||
|
1 |
0,79 |
желтая |
коричневая |
желто
- зеленая |
Кверцетин
100% |
По данным из таблицы 1 видно, что на каждой
хроматограмме препарата отмечается наличие 2 пятен, имеющих ярко – желтое окрашивание
при обычном свете и коричневое окрашивание в УФ-свете, которые приобретают желто-зеленую
флюоресценцию после обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида, что характерно
для флавонол-3-гликозидов, флавонов или их гликозидов. При этом по величине Rf
и характеру флюоресценции пятно №1 в каждой хроматограмме соответствует аналогичным
показателям РСО рутина, а пятно №2 – аналогичным показателям РСО кверцетина [6].
Вышеизложенное обосновывает тот факт,
что в препарате из шелухи лука репчатого (Аllium
сеpа) содержатся флавоноиды кверцетин и рутин.
Таким образом, с помощью метода хроматографического
анализа препарата, проведенного 5 раз, можно сделать вывод, что вероятность наличия
флавоноидов кверцетина и рутина в препарата равна – 98%. Следовательно, препарат
из шелухи лука репчатого (Аllium сеpа) содержит в себе растворенные биологически активные
вещества – растительные гетероциклические фенольные соединения – кверцетин и
рутин.
Выводы:
Исходя из того, что полученный
фитопрепарат содержит в себе большое количество биологически активных веществ,
таких как флаваноиды кверцетин и рутин, можно сделать предположение, что
препарат из шелухи лука репчатого (Аllium сеpа), скорее всего, можно использовать в сельском
хозяйстве (в области экологически чистого растениеводства), в радиоэкологии,
кроме того в пищевой биотехнологии, непосредственно в фармацевтике, а так же в
области биохимии и биофизики.
Вышеуказанные предположения обусловлены
тем, что флаваноиды кверцетин и рутин являются отличными стимуляторами роста
растений, кроме того они содержат большое количество (4-6) свободных
гидроксильных групп, что способствует поглощению свободных радикалов молекулами
кверцетина и рутина. Такое свойство молекул играет большую роль при лечении от
радиологического шока, облучения жесткими УФ-лучами и, возможно, в борьбе с
раковыми клетками и т.д.
Таким образом, ценность работы, в
известной степени, не зависит от полученного в ходе ее проведения результата, а
методика ее проведения и поставленные цели имеют перспективу продолжения в
будущем.
1. Кенунян И.Л. и
др. Флавоноиды: химическая энциклопедия. Москва: Советская энциклопедия, 1990.
34с.
2. Дубченко Л.Г., Козьяков
А.С., Кривенко В.В. . Пряно–ароматические и пряно–вкусовые растения: справочник.
Куоган: Наукова Думка, 1989. 304с.
3. Луковая шелуха.
Лечение от 100 болезней / Под ред. А.Н. Приходько. СПБ: Астрель, 2012. 18-22с.
4. Биологически активные
соединения растений Аllium сеpа и препараты на их основе. / Под ред. В.В. Полякова,
С.М. Адекенова. Алматы: Гылым, 1999. 160с.
5. Долгоносов А.М. Методы
колоночной аналитической хроматографии.- учебное пособие для студентов химических
специальностей. Дубна: Наукоград, 2009. 314с.
6. Рудаков
О.Б., Востров И.А. Спутник хроматографиста.
Воронеж: Водолей, 2004. 528с.