Жуков В.І., *Перепадя С.В., Моісеєнко А.С., Зайцева О.В., Кнігавко В.Г., Гранкіна С.С, Полещук К.О., Полещук О.П.

Харківський національний медичний університет, м. Харків, Україна
* Харківська медична академія післядипломної освіти, м. Харків, Україна

Вивчення рівнів ендогенної інтоксикації у хворих колоректальним раком при обтураційній товстокишковій непрохідності.

В останні роки сформувався новий напрямок в епідеміології раку – молекулярна епідеміологія, метою якої є пошук і практичне втілення специфічних, чутливих і прогностичних інформативних маркерів патогенного впливу оточуючого середовища і маркерів схильності індивідуумів до онкопатології. Властивості ферментів біотрансформації ксенобіотиків роблять можливим їх застосування в якості таких маркерів [1]. Пригнічення функції імунної системи є характерною особливістю любого онкологічного захворювання. Реакції метаболізму ксенобіотиків в мікросомах, як правило, супроводжуються утворенням реакційних метаболітів, які ковалентно зв’язуються з білками, формуючи природні кон’югуючі антигени, здатні викликати індукцію синтезу антитіл до цих ксенобіотиків [2]. Таким чином, мікросомальна монооксигеназна система, синтезуючи кон’юговані антигени в організмі, безпосередньо взаємодіє з системою імунітету, яка відповідає продукцією антитіл на хімічні речовини, що приєднані монооксигеназами до білку. Активація імунологічних функцій найрізноманітнішими хімічними агентами веде до характерного зсуву в цитохром Р₄₅₀ - залежному метаболізмі ксенобіотиків у печінці, що полягає в зменшенні вмісту цитохрому Р₄₅₀ в мікросомальній фракції і відповідному зниженні рівня окислення речовин. Практично будь-які агенти, неспецифічні (імуностимулятори, імуномодулятори) або специфічні (антигени), що активують систему імунітету, викликають однозначну реакцію з боку системи цитохрома Р₄₅₀. Значення і динаміка системи цитохромів Р₄₅₀ при онкологічних захворюваннях потребує подальших досліджень і представляє актуальну медико-біологічну проблему.

Метою роботи було вивчення стану мікросомальної монооксигеназної системи і рівнів ендогенної інтоксикації у хворих на колоректальний рак (КРР), ускладнений обтураційною товстокишковою непрохідністю.

Матеріали і методи дослідження. Програма досліджень передбачала визначення у хворих лейкоцитарного індексу інтоксикації (ЛІІ); продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ): дієнових кон’югатів, малонового діальдегіду (МДА); субстратів окислювальної модифікації білків: 2,4-динітрофенілальдогідразонів (2,4-ДНФАГ), 2,4-динітрофенілкетогідразонів (2,4-ДНФКГ), і молекул середньої маси (МСМ) в сироватці крові. Для більш повного дослідження рівнів ендогенної інтоксикації в лімфоцитах визначався вміст цитохрому Р₄₅₀. ПОЛ і окислювальну модифікацію білків досліджували також по рівнях інтенсивності біохемілюмінісценції (БХЛ) і фосфоресценції (ФС) сироватки крові. В першу групу було включено 30 хворих з компенсованою обтураційною товстокишковою непрохідністю (ІІІ стадія канцерогенезу), 16 чоловіків і 14 жінок, віком 63,5±6,2 років. До другої групи ввійшло 27 хворих з субкомпенсованою (ІVстадія) обтураційною непрохідністю (15 чоловіків, 12 жінок), віком 68,4±8,2 років. Група порівняння була сформована із 23 умовно здорових людей, що не пред’являли особливих скарг на стан здоров’я, віком 64,3±7,8 років (12 чоловіків, 11 жінок).

Рівень МСМ у сироватці крові визначали скринінговим методом [3] з наступним вимірюванням на спектрофотометрі при довжині хвилі λ=254нм. Результати виражали в умовних одиницях. Лейкоцитарний індекс інтоксикації визначали по Я.Я.Кальф-Каліфу. Інтенсивність спонтанної біохемілюмінесценції (СБХЛ), Н₂О₂- і люмінолзалежної індукованої хемілюмінесценції (ІБХЛ) сироватки крові реєстрували на медичному біохемілюмінометрі (ХЛМЦ-1-01). Вміст малонового діальдегіду в сироватці крові визначали тіобарбітуровим, а дієнових кон’югатів – ізопропанолгептановим методами [4]. Рівень окислювальної модифікації білків оцінювали по концентрації карбонільних груп, що реагують з 2,4-динітрофенілгідразоном. По вмісту продуктів реакції: 2,4-ДНФАГ і 2,4-ДНФКГ судили про стан перикисного окислювання білків [5]. Оцінку структурно-функціонального стану білків виконували шляхом дослідження інтенсивності фосфоресценції сироватки крові [6]. Визначення активності цитохрому Р₄₅₀ із субстратом бензпіреном у лімфоцитах крові здійснювали по реакції гідроксилювання субстрату. Інтенсивність реакції оцінювали по флуоресценції субстрату 3-гідроксибензопірену [2,7]. Інтенсивність активності бензпіренгідроксилази виражали в одиницях флюоресценції/мг білку/хвилину.

Статистичний аналіз отриманих результатів проводився з використанням методів варіаційної статистики і оцінкою вірогідності відмінностей по t-критерію Ст’юдента-Фішера.

Результати дослідження і їх обговорення. Аналіз результатів дослідження виявив підвищення в сироватці крові хворих на КРР з обтураційною товстокишковою непрохідністю вмісту МДА, дієнів, 2,4-ДНФАГ, 2,4-ДНФКГ, МСМ і лейкоцитарного індексу інтоксикації (табл.1) у порівнянні з групою «умовно здорові».

Таблиця 1

Стан показників ендогенної інтоксикації у хворих на КРР при обтураційній товстокишковій непрохідності

Показники	Група спостереження, М±m
	Умовно здорові пацієнти (n=23)	Компенсована обтураційна непрохідність (n=30)	Субкомпенсована обтураційна непрохідність (n=27)
ІБХЛ (імп/сек)	752,6±149,7	347,2±15,4*	246,5±16,2*
Фосфоресценція (імп/сек)	1228,7±82,3	2962,3±120,5*	3784,6±153,4*
МДА (мкмоль/л)	2,1±0,18	4,3±0,5*	4,9±0,8*
Дієни (ммоль/л)	9,2±0,67	28,3±1,5*	31,6±2,3*
2,4-ДНФАГ (од.опт.щільн./1г білку, λ=370нм)	27,3±1,86	59,4±3,8*	62,7±1,49*
2,4-ДНФКГ (од.опт.щільн./1г білку, λ=380нм)	23,8±2,13	66,5±3,2*	71,21±2,5*
МСМ (ум.од)	0,22±0,02	0,62±0,05*	0,68±0,09*
ЛІІ	1,3±0,07	4,7±0,7*	5,1±0,8*

Примітка: * - різниця показників з групою «умовно здорові» вірогідна, р< 0,05

Так, виявлено підвищення рівня МДА при компенсованій стадії на 204,7% і при субкомпенсованій на 308% у порівнянні з групою умовно здорових пацієнтів. Подібна динаміка в сироватці крові відмічалась і для дієнових кон’югатів. Їх вміст зростав у порівнянні з групою умовно здорових пацієнтів на 307% і 343%, відповідно при ІІІ і ІV стадіях пухлинного процесу. Рівні продуктів окислювальної модифікації білків - 2,4-ДНФАГ підвищувались на 117,5% і 130%, а 2,4-ДНФКГ – на 179% і 199%, відповідно при компенсованій і субкомпенсованій товстокишковій непрохідності. Кількість середньомолекулярних пептидів у хворих на КРР при компенсованій обтураційній непрохідності зростала в сироватці крові на 180% і при субкомпенсованій стадії непрохідності на 209%. Лейкоцитарний індекс інтоксикації у хворих підвищувався на 206% і 290%, відповідно при компенсованій і субкомпенсованій обтураційній непрохідності у порівнянні з контролем.

Дослідження свідчать, що рівні МДА, дієнів, 2,4-ДНФАГ, 2,4-ДНФКГ, МСМ і ЛІІ при компенсованій обтураційній непрохідності підвищувались у 2; 3; 2,17; 2,8; 2,8 і 3,5 рази і відповідно при субкомпенсованій непрохідності – в 2,33; 3,43; 2,30; 3,0; 3,09; 3,92 рази. Ці дані показують, що розвиток ендогенної інтоксикації при КРР супроводжується суттєвим зростанням ЛІІ, вмісту МСМ, альдо- і кетогідразонів та дієнових кон’югатів. Ці сполуки здатні змінювати внутрішньоклітинний метаболізм і функцію клітини.

Вивчення інтенсивності ІБХЛ сироватки крові хворих виявило зворотню залежність цього показника від ступеню обтураційної непрохідності. При компенсованій (ІІІ стадія) і субкомпенсованій (ІV стадія) непрохідності рівні інтенсивності надслабкого світіння знижувались до 347,2±45,4 (імп/с на 53,9%) і 246,5±36,2 (імп/с на 67,3%). На думку багатьох авторів [4,6,8], така динаміка інтенсивності БХЛ може віддзеркалювати пригнічення процесів біоенергетики, які найбільш виразні у хворих із субкомпенсованою товстокишковою непрохідністю при ІV стадії канцерогенезу.

Слід зазначити, що вивчення фосфоресценції виявило її зростання в залежності від стадії кишкової непрохідності. У хворих при компенсованій обтураційній непрохідності інтенсивність фосфоресценції підвищувалась на 241,2% і при субкомпенсованій – на 308%. Ці дані свідчать, що в умовах розвитку КРР у сироватці крові підвищується кількість молекул, які є реакційно-здатними і можуть ушкоджувати макромолекули (білки, нуклеїнові кислоти та ін.), мембрани клітин і внутрішньоклітинних органел. На думку ряда авторів, до субстратів ендогенної інтоксикації відносяться активні форми кисню, продукти перекисного окислення ліпідів і окислювальної модифікації білків: перекиси, гідроперекиси, дієнові кон’югати, малоновий діальдегід, кетони, спирти, альдо- і кетогідразони та інші низькомолекулярні реакційні молекули [4,8]. Підвищення їх рівня в крові є прогностично негативною ознакою, яка вказує про деградацію біополімерів, надмолекулярних комплексів та порушення структурно-метаболічних і фізико-хімічних властивостей клітинних мембран [4,5,8].

Результати дослідження активності гідроксилюючої монооксигеназної системи лімфоцитів показали, що активність ферменту мікросомального окислення цитохрому Р₄₅₀ у хворих на КРР була підвищена при компенсованій обтураційній товстокишковій у 1,86 рази (на 86%), а при субкомпенсованій стадії – у 2,01 рази (на 101%) у порівнянні з групою «умовно здорові».

Таблиця 2

Активність цитохрому Р₄₅₀ у хворих на КРР при обтураційній товстокишковій непрохідності (одиниці флюоресценції/мг білку хв., субстрат бензпірен)

Групи спостереження, М±m
Умовно здорові пацієнти (n=23)	Компенсована стадія обтураційної непрохідності (n=30)	Субкомпенсована стадія обтураційної непрохідності (n=27)
9,42±0,64	17,53±1,25*	18,97±1,38*

Примітка: * - різниця з показниками групи «умовно здорові» вірогідна, р< 0,05

У літературі є дані, які вказують на те, що в людській популяції спостерігаються великі індивідуальні відмінності в активності детоксикаційної системи мікросом. Вони пов’язані з ДНК-поліморфізмом цитохрому Р₄₅₀, що, в свою чергу, поєднують із різною схильністю розвитку злоякісних новоутворень [9]. Автори висловлюють думку, що індивідуальна варіабельність метаболічної активності монооксигеназної системи може бути ключовим фактором для пояснення різної чутливості людей до хімічних канцерогенів і їх схильності до онкологічних і професійних захворювань.

Таким чином, аналіз досліджень виявив у хворих на КРР з обтураційною товстокишковою непрохідністю розвиток ендогенної інтоксикації, яка супроводжується суттєвим підвищенням у сироватці крові продуктів перекисного окислення ліпідів, окислювальної модифікації білків на тлі активації мікросомальної монооксигеназної системи. Розвиток токсифікації організму хворих має залежність від ступеню тяжкості перебігу захворювання і протікає в умовах формування біоенергетичної і імунологічної недостатності. Критеріально-значущими і прогностичними показниками можуть бути інтенсивність БХЛ, величини ЛІІ, МСМ та вміст альдо- і кетогідразонів у сироватці крові.

Література

[1] Ляхович В.В., Вавилин В.А., Гуткина Н.И., и др. Гены и ферменты системы метаболизма ксенобиотиков в онкопатологии //Вопросы мед. химии, 1997.-Т.43, №5.–С.330-338.

[2] Ковалев И.Е., Шипулина Н.В., Томилина Н.Ю. Индукция цитохрома Р₄₅₀ и последующая индукция иммунного ответа у крыс при хроническом введении ксенобиотиков //Фармакология и токсикология, 1990.-Т.53, №1–С.54-57.

[3] Николайчук В.В. «Средние молекулы» - образование и способы определения //Лаб.дело, 1989.-№8.–С.31-33.

[4] Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., Перикисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.–320с.

[5] Дубинина Е.Е., Бурмистрова С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, методы ее определения// Вопросы мед.химии, 1995.-Т.41,№4.–С.24-26.

[6] Зайцева О.В., Жуков В.И., Бондаренко Л.А., Абашин В.М. Использование биохемилюминесценции и фосфоресценции при изучении влияния химических факторов производственной среды на организм // Новые биофизические методы в медицине.- Ворошоловград.-1990.–С.20-21.

[7] Згода В.Г., Карузина И.И., Арчаков А.И. Самоинактивация цитохрома Р₄₅₀ 2В4 в ходе каталитического цикла в монооксигеназной реконструированной системе //Вопросы мед. химии, 1997.-№4.–С.217-225.

[8] Жуков В.И. Детергенты–модуляторы радиомиметических эффектов. Белгород, 2000.–450с.

[9] Райхман Я.Г., Нидюлин В.А. Управление канцерогенной ситуацией и профилактика рака (системный подход) // Вопросы онкологии, 1999.–Т.45, №2.–С.50-58.