Микробиология

К.б.н. Лахтин М.В., д.м.н. проф. Афанасьев С.С., д.б.н. Лахтин В.М.,

д.б.н. проф. Алешкин В.А.

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

ГЛИКОКОНЪЮГАТЫ-РАСПОЗНАЮЩИЕ СИСТЕМЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР

Резюме

С помощью хемилюминесцентного анализа идентифицированы визуальные паттерновые новые белковые гликоконъюгаты-распознающие системы культуральных жидкостей перспективных пробиотических штаммов бифидобактерий и лактобацилл. Системы одновременно распознавали сочетания различных полимерных поливалентных разветвленных гликоконъюгатов муцинового типа. Представлены данные о минимизированных и максимальных гликоконъюгаты-распознающих системах.

Ключевые слова: бифидобактерии, лактобациллы, культуры, типирование, лектины, гликоконъюгаты, пробиотики.

Resume

Lakhtin M.V., Afanasiev S.S., Lakhtin V.M., Aleshkin V.A. G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology & Microbiology, Russia. Glycoconjugates-recognizing systems of bacterial cultures.

New protein glycoconjugates-discriminating visual pattern systems of cultural fluids of perspective probiotic strains of bifidobacteria and lactobacilli were identified using chemiluminescent analysis. The systems simultaneously discriminated combinations of different polymeric polyvalent branched glycoconjugates of mucin type. Lectins as minimal (visible only major localized forms) and completed maximal (localized minors together with major forms) systems were described.

Key words: bifidobacteria, lactobacilli, cultures, typing, lectins, glycoconjugates.

Введение: Лектины пробиотических бактерий относятся к новому классу деструкторов биопленок условно патогенных микроорганизмов, гликоконъюгаты(ГК)-связывающим системным белкам неиммуноглобулиновой природы, регулирующим метаболизм и имитирующим действие пробиотиков [1, 2]. Ранее нами были описан ряд новых лектиновых систем пробиотических бактерий [3]. Цель –исследовать одновременное распознавание лектиновыми системами культуральных жидкостей (КЖ) пробиотических бактерий различных сочетаний ГК .

Материалы и методы: Исследовали B. bifidum 791, B. longum В379М , B.longum Х, B. pseudocatenulatum OV-2, B. pseudocatenulatum OV-15, Lactobacillus helveticus NK1 и L. amylovorus БТ-24/88. Штаммы - из Коллекции микроорганизмов при МИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Высокомолекулярные компоненты (> 27 кД, pI 4-5) концентратов супернатантов культуральных жидкостей (КЖ) бактерий, выращенных в гидролизованом молоке с добавками и в среде КД-5с, разделяли изоэлектрофокусированием в пластине полиакриламидного геля в присутствии мочевины и сахарозы, электроблотировали на гидрофобную мембрану и проявляли лектины с помощью системы ГК-биотин—Стрептавидин-пероксидаза [1, 3]. Использовали биотинилированные ГК на основе линейной цепи полиакриламида с боковыми множественными/кластерными ответвлениями коротких цепей с моно- или дисахаридными остатками, имитирующие гликопротеины и полисахариды с множественными экспонированными короткими гликанами муцинового типа (www.lectinity.com). Связавшуюся c различными ГК-блотами пероксидазу одновременно проявляли хемилюминесцентным субстратом в камере для детекции хемилюминесценции и кинетику хемилюминесценции лектиновых систем регистрировали в режиме реального времени в системе BioChemi System (UVP, Calif.) в виде серии последовательных во времени картин. Использовали следующие ГК (в скобках синонимы): *Fuc-альфа1- [псевдо(альфа-L-фукан)],

*GalNAc-альфа1,3Gal-бета1- [A_di; поли(AII-группы крови-антиген)],

*GalNAc-альфа1,3GalNAc-бета1- [F_s; поли(антиген Форсмана)],

*GalNAc-бета1- [десиалированный псевдомуцин],

*Gal-бета1,4GlcNAc-бета1- [поли(LacNAc)-содержащий псевдомуцин],

*Man-альфа1- [псевдо(альфа-D-маннан)],

*(MurNAc-L-Ala-D-isoGln)β1- [MDP-; псевдопептидогликан].

Результаты: 1. Продемонстрирована способность лектинов КЖ пробиотических бактерий одновременно распознавать ГК: псевдоманнан и псевдомуцин, псевдопептидогликан и полимер антигена Форсмана, псевдофукан и полимер дисахарида А(II)-группы крови (рис. 1). Картины связывания ГК зависели от принадлежности бактерий к роду, виду, штамму. Обнаруживалось сходство в области белкового массива с рI 4.5-5.0 у систем лектинов, взаимодействующих с псевдоманнаном или псевдопептидогликаном. 2. Лектиновые системы КЖ бактерий представлены как минимизированные мажорные и с максимальным набором форм (для выявления минорных компонентов). 3. Лектиновые системы КЖ пробиотических бактерий классифицированы как: 1) Иерархические (одна или несколько входят друг в друга; например, псевдоманнан-альфа- и псевдопептидогликан-распознающие системы с максимальным количеством компонентов подсистем с другой специфичностью к ГК; псевдомуцинсвязывающая система как субсистема в пептидогликанузнающей системе). 2) Сходные (с сильно выраженным перекрыванием компонентов; имеют место тонкие различия по выраженности и числу некоторых компонентов; примерами могут служить псевдоманнан-альфа- и псевдопептидогликан- распознающие [псевдопептидогликанузнающие (преимущественно верхняя часть массива плюс середина массива как у псевдомуцинсвязывающих) - примерно одинаковая с псевдоманнан-альфа-узнающей (верхняя часть массива)]; псевдофукан-альфа- и антиген-Форсмана-распознающие). 3) Сильно различающиеся (допустимы перекрывания областей компонентов; например, полимер А_di- и псевдофукан-распознающие). 4) Уникальные (требуется расширенный набор ГК для подтверждения). 5) Визуализирующие в различной степени белковый массив (рI 4.2-4.8) и примыкающие области: а) полимер А_di- связывающие (протяженные; преимущественно нижняя часть массива) как более выраженные чем связывающие псевдомуцин (более узкие области; примерно середина массива); б) псевдопептидогликансвязывающие (преимущественно верхняя часть массива плюс середина массива как у псевдомуцинсвязывающих) примерно одинаково с псевдоманнан-альфа-связывающими (примерно верхняя часть массива); в) псевдофукан- и псевдомуцин-распознающие (нижняя часть массива).

Заключение: Предложенный способ одновременной детекции кинетики узнавания белковыми системами пар различных типов ГК важен для более точной оценки и более точного ранжирования/типирования специфичности белков к в равной степени доступным нескольким мишеням. Идентификация мажорных и минорных ГК-связывающих форм перспективна для скрининга грамположительных продуцентов ГК-распознающих систем, выявления форм для препаративных целей, мониторинга постгеномного усиления (снижения) в КЖ минорных (мажорных) потенциально регуляторных/сигнальных (или макрофункциональных) форм лектинов и их комплексов, в зависимости от времени и изменения условий среды и выбора штамма.

Литература:

1. Lakhtin M., Lakhtin V., Aleshkin A., Bajrakova A., Afanasiev S., Aleshkin V. Lectin systems imitating probiotics: potential for biotechnology and medical microbiology. In: “Probiotics 2012”, Edited by E.C. Rigobelo. 2012. P. 417 – 432. ISBN 978-953-51-0776-7. http://dx.doi.org/10/5772/3444.

2. Lakhtin M., Aleshkin V., Lakhtin V., Afanasiev S., Pozhalostina L., Pospelova V. Probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium lectins against Candida albicans and Staphylococcus aureus clinical strains: New class of pathogen biofilm destructors. Probiotics & Antimicrobial Proteins. 2010. V. 2. P. 186 - 196.

3. Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Лахтин В.М., Алешкин В.А. Новые гликоконъюгаты-распознающие системы в культуральных жидкостях перспективных пробиотических штаммов бифидобактерий и лактобацилл // Materiały IX Międzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji «Wykształcenie i nauka bez granic - 2013» Volume 37. Nauk biologicznych. : Przemyśl. Nauka i studia – 64-68. ISBN 978-966-8736-05-6.

рН5

pH3

Man(I) GalNAc(I) Man(II) GalNAc(II)

А 1 2 3 4 5 6 7 8 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 5 6 7 8

рН5

pH3

Fs(I) MDP(I) Fs(II) MDP(II)

Б 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3

Рис. 1. Одновременное узнавание лектинами псевдоманнана (Man) и псевдомуцина (GalNAc) [А], полимерного псевдоантигена Форсмана (F_s) и псевдопептидогликана (MDP) [Б]. 1- L. helveticus NK1 (КД-5c), 2- L. helveticus NK1, 3- L. amylovorus БТ24/88, 4- B. longum Х, 5- B. longum B379M, 6- B. bifidum 791, 7- B. pseudocatenulatum OV-2, 8- B. angulatum OV-15. I - системы локализованных мажорных форм, II - системы локализованных миноров и мажорных форм лектинов.