Микробиология

К.б.н. Лахтин М.В., д.м.н. проф. Афанасьев С.С., д.б.н. Лахтин В.М.,

д.б.н. проф. Алешкин В.А.

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

ДОТ-БЛОТОВЫЙ АНАЛИЗ ГЛИКОКОНЪЮГАТЫ-СВЯЗЫВАЮЩИХ

ЛЕКТИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР

Резюме

Оптимизирована дот-блотинговая хемилюминесцентная оценка липид- и водорастворимых гликоконъюгаты-связывающих лектинов культур бактерий на примере пробиотических штаммов бифидобактерий и лактобацилл. Препараты лектинов в рабочих разведениях распознавали стандартные растворимые полимерные поливалентные гликоконъюгаты с известной структурой. Идентифицированы препараты с мажорными и минорными лектинами с установленной специфичностью. Наборы препаратов лектинов с взаимодополняющими специфичностями перспективны для выявления гликоконъюгатов и получения синергистических композиций.

Ключевые слова: бифидобактерии, лактобациллы, лектины, гликоконъюгаты, культуры.

Resume

Lakhtin M.V., Afanasiev S.S., Lakhtin V.M., Aleshkin V.A. G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology & Microbiology, Russia. Dot-blot analysis of glycoconjugates-binding lectin preparations isolated from bacterial cultures.

Dot-blot evaluation of lipid- or water-soluble glycoconjugates-binding lectins from bacterial cultures was optimized on the example of probiotic strains of bifidobacteria and lactobacilli. Lectin preparations at work dilutions were effective in recognition of soluble polymeric polyvalent glycoconjugates of known structures. Combinations of lectin preparations possessing different specificities are perspective for revealing glycoconjugates and obtaining synergistic compositions.

Key words: bifidobacteria, lactobacilli, lectins, glycoconjugates, cultures.

Введение: Лектины относятся к гликоконъюгаты(ГК)-связывающим белкам неиммуноглобулиновой природы. Лектины пробиотических бактерий относятся к новому классу деструкторов биопленок условно патогенных микроорганизмов; они имитируют действие пробиотиков [1-3]. Дот-блотинг является простым первичным экспресс-методом оценки функциональных белков. Цель – оптимизировать дот-блотинговый метод скрининга препаратов лектинов грамположительных бактерий на примере лактобацилл и бифидобактерий.

Материалы и методы: Исследовали B. longum В379М , B. pseudocatenulatum OV-2, B. pseudocatenulatum OV-15, Lactobacillus helveticus NK1, L. amylovorus БТ-24/88 и другие штаммы - из Коллекции микроорганизмов при МИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Из выращенных в обезжиренном гидролизованом молоке с добавками эпидермата и инулина и в казеиново-дрожжевой среде (КД-5с) бактериальных культур получали в результате замораживания верхнюю сливочную фракцию и деэмульсифицированные супернатанты. Супернатанты стерилизовали микрофильтрацией в Steriflip (Millipore) и концентрировали с получением высокомолекулярных компонентов (> 27 кД) в буфере для электрофореза. Липидные (сливочные) фракции экстрагировали 10% водным метанолом с 7% уксусной кислотой, экстракты стерилизовали микрофильтрацией в Steriflip (Millipore) и концентрировали с получением высокомолекулярных компонентов (> 27 кД) в буфере для электрофореза. Все концентраты (7 мкл или более) термообрабатывали, добавляли 1% твин-80, наносили на аппликаторы в катодной области и разделяли высоковольтным изоэлектрофокусированием в пластине полиакриламидного геля в градиенте рН 2-6 в присутствии мочевины и сахарозы. Области геля между электродами в треках образцов нарезали на фракции (по 0.5 см геля – между катодом и метиловым красным pI 3.75 и по 1 см – между метиловым красным и анодом с рН 2.9). Гели замораживали, размораживали, измельчали, экстрагировали 10 мМ фосфатносолевым буфером рН 7.4 (ФСБ). Компоненты концентрировали, промывали ФСБ, повторно концентрировали в центрифужных стаканах Centricon Plus-20 (Millipore). Готовили серии разбавлений образцов концентратов в ФСБ. Пробы (3 мкл) серий разведений точечно наносили на гидрофобную мембрану Immobillon P (PVDF) (вымоченную в метаноле, воде и затем отжатую - влажную) на стекле, которую промывали ФСБ с 0.005% твином-20 (ФСБ-твин). Лектины проявляли биотинилированными ГК (www.lectinity.com) [0.5-1 мкг/мл, в ФСБ-твин; ночь при 5^оС], стрептавидин-пероксидазой (Pierce Biotechnology) в рабочем разведении в ФСБ-твине (сток- 1 мг/мл, взято 10 мкл/100 мл буфера [в 40 раз меньше, чем в случае детекции белкового гормона]; контакт с блотом 30-60 мин при 37^оС). Добавляли хемилюминесцентный с повышенной продолжительностью излучения субстрат пероксидазы BioWest (UVP) и последовательно регистрировали (в выбранном нелинейном алгоритме ступенчатой смены возрастающего времени накопления сигнала) серии картин хемилюминесценции (интервалы накопления сигнала - от 10 сек до 15 мин; подбирали режимы регистрации расположения всех дотов на мембране после окончания работы с мембраной) в системе BioChemi System (UVP) при комнатной температуре, как описано ранее [4]. Использовали пакет программ LabWork для получения изображения, его редактирования и анализа. Использовали водорастворимые полимерные поливалентные ГК на основе линейной цепи полиакриламида (ПАА) с боковыми кластерными ответвлениями моносахаридов или коротких гликанов – имитаторов разветвленных природных полисахаридов муцинового типа (в скобках - синонимы): Fuc-альфа1-ПАА [псевдо(альфа-L-фукан)]; GalNAc-альфа1,3Gal-бета1-ПАА [A_di; поли(AII-группы крови-антиген)]; GalNAc-альфа1,3GalNAc-бета1-ПАА [F_s; поли(антиген Форсмана)]; GalNAc-бета1-ПАА [десиалированный псевдомуцин]; Man-альфа1-ПАА [псевдо(альфа-D-маннан)].

Результаты: 1. Идентифицированы лектины (преимущественно в белковом массиве с pI 4-5) кульутур пробиотических штаммов лактобацилл и бифидобактерий, распознающие псевдофукан, полимер дисахарида А(II)-группы крови, псевдоманнан, полимер антигена Форсмана и псевдомуцин (рис. 1). 2. Эффективные рабочие разведения лектиновых препаратов составляли 600-17000 раз. Минимальная чувствительность метода – разбавления концентратов в 16-17 тысяч раз в случае обнаружения псевдофукансвязывающих лектинов бифидобактерий (слабее - в случае лактобацилл, например, L. helveticus NK1; более выраженная дотовая локализация). Метод выявляет (полимер А_di)-связывающие бифидобактериальные или псевдоманнан-альфа-связывающие лактобациллярные лектины в разбавлениях концентрата 600-700 раз (все – точечно локализованы, время накопления сигнала – 10-15 мин). 3. Бифидобактериальные и лактобациллярные препараты лектинов с различающимися значениями pI проявляли преимущественно моноспецифичность. Картины ГК-специфичности видов бифидобактерий или бифидобактерий и лактобацилл были взаимодополняемыми. 4. В липидсодержащей фракции бактериальных культур выявлены псевдомуцин-, псевдоманнан- и (полимер антигена)-связывающие лектины, картины распределения которых дополняли аналогичные картины водорастворимых лектинов (время накопления сигнала – 1.5-2.5 мин). 5. Продемонстирована универсальность метода в скрининге мажорных и минорных лектинов, в том числе водорастворимых и растворимых в кислом водном растворе метанола (требовался подбор режима накопления сигнала в дотовой смеси выбранного препарата лектинов и выбранного типа ГК).

Выводы: 1. Оптимизирован способ детекции узнавания препаратами высокомолекулярных компонентов культур грамположительнгых бактерий различных ГК. 2. Для выявления лектинов необходимы их рабочие (эффективные) разведения. 3. Для выявления и идентификации муцинсвязывающих лектинов вместо псевдомуцина (GalNAc-) следует использовать полимер А_di, полимер F_s, другие GalNAc-содержащие ГК с повышенной специфичностью ди/олигосахарид-ПАА. 4. Взаимодополняющие друг друга картины ГК-специфичности отличающихся по pI лектинов отражают свойства общей бифидобактериальной или бифидо-лактобациллярной расширенной пробиотической системы распознавания окружающих ГК-мишеней, в том числе с потенциально про/пребиотической направленностью (с компонентами различных pI-фракций различных видов бифидобактерий и лактобацилл). 5. Комбинирование препаратов лектинов пробиотических бактерий может служить алгоритмом конструирования взаимодополняющих синергистических про/пре/синбиотических систем (по ГК-специфичности, сочетанию бифидобактериальных, лактобациллярных или бифидобактериальных и лактобациллярных бесклеточных и/или клеточных ингредиентов), биосовместимых с организмом человека. 6. Метод характеризуется универсальностью в решении задач и может быть использован для скрининга минорных (потенциально сигнальных) форм лектинов в культурах штаммов и видов грамположительных бактерий. 7. Результаты подтверждают данные идентификации систем водорастворимых лектинов бифидобактерий и лактобацилл в белковом массиве на блоте до изоляции лектинов из геля [4], что указывает на эффективность выбранных в работе условий экстракции лектинов и последующего приготовления лектиновых препаратов без существенных потерь.

Литература:

1. Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Alyoshkin V.A., Afanasyev S.S. Lectins of beneficial microbes: system organization, functioning and functional superfamily. Beneficial Microbes. 2011. V. 2; No 2. P. 155 – 165. DOI 10.3920/BM2010.0014.

2. Lakhtin M., Lakhtin V., Aleshkin A., Bajrakova A., Afanasiev S., Aleshkin V. Lectin systems imitating probiotics: potential for biotechnology and medical microbiology. In: “Probiotics 2012”, Edited by E.C. Rigobelo. 2012. P. 417 – 432. ISBN 978-953-51-0776-7. http://dx.doi.org/10/5772/3444.

3. Lakhtin M., Aleshkin V., Lakhtin V., Afanasiev S., Pozhalostina L., Pospelova V. Probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium lectins against Candida albicans and Staphylococcus aureus clinical strains: New class of pathogen biofilm destructors. Probiotics & Antimicrobial Proteins. 2010. V. 2. P. 186 - 196.

4. Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Лахтин В.М., Алешкин В.А. Новые гликоконъюгаты-распознающие системы в культуральных жидкостях перспективных пробиотических штаммов бифидобактерий и лактобацилл // Materiały IX Międzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji «Wykształcenie i nauka bez granic - 2013» Volume 37. Nauk biologicznych. : Przemyśl. Nauka i studia – 64-68. ISBN 978-966-8736-05-6.

Man(I) A_di(I) GalNAc(I) Fuc(I) Man(II) A_di(II) GalNAc(II) Fuc(II)

Man(I) A_di(I) GalNAc(I) Man(II) A_di(II) GalNAc(II) Fs

GalNAc(I) GalNAc(II) *GalNAc(I) *GalNAc(II)

Рис. 1. Распознавание ГК дотовыми лектиновыми препаратами на иммобиллоне-П. Слева-направо - изменение степени разбавления препаратов. Сверху-вниз – изменение типов препаратов бактерий. ГК: псевдоманнан (Man), полимерный дисахаридный антиген А(II)-группы крови (A_di), полимерный антиген Форсмана (F_s), псевдофукан (Fuc) и псевдомуцин (GalNAc). I и II- примеры сравнительного усиления визуализации лектинов в рядах фотографий. *- Лектины сливочной фракции (правая часть мембраны с дотами).