Д

Д.м.н. Холодок Г.Н.¹, к.м.н. Стрельникова Н.В.², к.м.н. Ефименко¹, М.В., к.м.н. Кольцов И.П.², д.м.н. Козлов В.К. ¹

Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства, Хабаровск¹, Россия

Дальневосточный государственный медицинский университет, Хабаровск²

Антилизоцимная активность оппортунистических бактерий в микробиоте респираторного тракта у детей

Важным фактором колонизации и персистирования возбудителя в организме хозяина является продукция бактериями секретируемых субстанций, инактивирующих факторы иммунитета. Лизоцим - один из ведущих факторов местного иммунитета [1]. Этот фермент обладает бактерицидной активностью и присутствует во многих клетках, тканях и секреторных жидкостях организма - в лейкоцитах, слюне, слезной жидкости. Способность бактерий специфически инактивировать лизоцим определяется как антилизоцимная активность. В литературе указывается на преобладание антилизоцимной активности у грамотрицательных бактерий и редкое выявление этого признака у грамположительных [2]. Антилизоцимная активность (АЛА) выявляется у штаммов бактерий, вызывающих воспалительный процесс в тканях организма, то есть определяют их инвазивную активность, а степень ее активности свидетельствует о патогенности микроорганизма и инвазивном потенциале бактерий.

Цель: выявить маркеры инвазивности штаммов оппортунистических бактерий, колонизирующих микробиоту респираторного тракта у детей.

Методы: Исследовали трахеальный аспират детей, больных внебольничной пневмонией, госпитализированных в Клинику Института охраны материнства и детства (1-я группа, n=973) и назофаренгиальные мазки у здоровых детей (2-я группа, n=519), стандартными микробиологическими методами в период 2002-2010 гг. Определяли спектр бактерий, колонизирующих носоглотку, в том числе оппортунистических, способных вызывать воспалительный процесс респираторного тракта. АЛА бактерий, потенциальных возбудителей респираторной инфекции, определяли по О. В. Бухарину и соавт. (1984) [1] у 89 штаммов изолированных бактерий. Собственную антагонистическую активность бактерий изучали в модифицированном нами методе по выявлению АЛА. Лизоцим слюны в % активности устанавливали фотонефелометрическим методом. Сравнили частоту выявления и степень АЛА и собственную антагонистическую активность штаммов микроорганизмов, изолированных из образцов в изучаемых группах пациентов.

Результаты и обсуждение. У штаммов микроорганизмов, выделенных из клинических образцов (1-я группа ) установлена высокая частота и повышенная степень АЛА. При постановке опыта с использованием принципа «отсроченного антагонизма» в случае отсутствия роста тест-культуры M.lyzodecticus ATСС 2635 вокруг исследуемого штамма результат a priori расценивается как отрицательный результат наличия антилизоцимной активности и наоборот наличие роста – как положительный результат (рис. 1).

251658240 $C:\Documents and Settings\Admin\Мои документы\Диссертация флэшка\Бак экперимент АЛА июнь 2009\DSC04324.JPG$

Рис. 1. Рост тест-штамма M.lyzodecticus ATSS 2635 вокруг штаммов S.aureus, обладающих антилизоцимной активностью (концентрация лизоцима в питательной среде 0.2 мкг/мл)

Наибольшую антилизоцимную активность выявляли у Staphylococcus spp. - в 100% случаев с концентрацией 3,98±0,68 мкг/мл лизоцима в питательной среде, меньшую активность - у Streptococcus spp. - в 99,1%. с концентрацией лизоцима 3,05±0,89 мкг/мл и у штаммов Candida spp. в 99,8% случаев с концентрацией лизоцима 2,83±0,46 мкг/мл.

Выявлено также достоверное повышение активности лизоцима слюны у детей с внебольничной пневмонией (7,69±0,83 ед/мл/мин.) в сравнении с показателями здоровых детей (3,96±0,03 ед/мл/мин.) (р=0,03), свидетельствующее об однонаправленности этого процесса и увеличения АЛА клинических штаммов бактерий (табл.1).

Таблица 1.

Активность лизоцима слюны у детей с внебольничной пневмонией и у здоровых (M±m)

Группы наблюдения	Активность лизоцима (ед/мл/мин)
Внебольничная пневмония (n=37)	7,69±0,83
Контроль (n=10)	3,96±0,03
p	0,03

У штаммов оппортунистических микроорганизмов, выделенных из носоглотки у носителей установлены более низкая частота и уровни АЛА. У 93% штаммов Staphylococcus spp. АЛА выявляли только при низкой концентрации лизоцима в питательной среде - 0,93±0,73 мкг/мл, у 76% штаммов Streptococcus spp. - при 2,14±0,22 мкг/мл, и только у 48% изолятов Candida spp. При - 1,03±0,51 мкг/мл, и что свидетельствует об адаптации носоглоточных штаммов к условиям колонизации.

Установлено отсутствие АЛА у 40% штаммов грамотрицательных бактерий, изолированных из трахеального аспирата, что расходится с литературными данными о ее наличии у 90% грамотрицательных бактерий [ 3]. Это указывает на носоглоточное происхождение значительной части штаммов, изолированных из трахеального аспирата у детей с пневмонией, что может быть обусловлено некачественно собранными для исследования образцами.

Кроме наличия АЛА, выявлено выделение опытными штаммами собственных бактериоцинов, антагонистически влияющих на тест-культуру микрококка (табл.2). Установили 4 степени антагонистической активности микроорганизмов по отношению к микрококку: высокая – диаметр зоны задержки роста микрококка ≥20 мм, средняя – 15-19 мм, низкая – 10-14 мм и минимальная – до 10 мм. Среди бактерий с высоким уровнем бактерицидной активности к микрококку чаще выявляли микроорганизмы, колонизирующие носоглотку.

Таблица 2.

Уровни антагонистической активности микроорганизмов по отношению к тест-штамму M.lyzodecticus ATSS 2635 (абс. / %±m)

Род/вид микроорганизмов	Число исследований (n)	Степень активности
Род/вид микроорганизмов	Число исследований (n)	высокая	средняя	низкая	минимальная	отрицательная
E.coli	27	2/7,4±5,0	5/18,5±7,4	-	-	20/ 74,1±8,4
P.auruginosa	8	4/50,0±17,7*	-	-	-	4/50,0±17,7
C.albicans	9	6/66,7±15,7**	-	-	-	3/ 33,3±15,7
Enterobacter spp.	6	2/33,3±19,2	-	-	-	4/66,7±19,2
S.aureus	29	-	-	3/10,3±5,6	13/44,8±9,2	13/44,8±9,2
Lactobacillus spp.	6	3/50,0±20,4*	-	-	-	3/ 50,0±20,4
Всего	85	17/20,0±4,3	5/5,9±2,6	3/3,5±2,0	13/15,3±3,9	47/55,3±5,3

Примечание. Различие достоверно в столбцах с E.coli : * p<0,05; ** p<0,01

Антагонистическую активность высокой степени по отношению к микрококку достоверно чаще (р<0,05) определяли у носоглоточных штаммов P.auruginosa, C.albicans и Lactobacillus spp. - в 50,0±17,7% , 66,7±15,7% и 50,0±20,4% случаев соответственно, чем у E coli – в 7,4±5,0% случаев. В данном случае вероятность принадлежности штаммов E coli к инвазивным штаммам возрастает.

Таким образом, показатели антилизоцимной активности оппортунистических микроорганизмов, изолированных из респираторных образцов, выявляемые при концентрации лизоцима в питательной среде от 3,98 до 2,83 мкг/мл могут являться маркерами инвазивной активности оппортунистических микроорганизмов и, напротив, низкие – с концентрацией лизоцима в питательной среде менее 2,14 мкг/мл, - маркерами носоглоточных изолятов, адаптированных к условиям колонизации в микробиоте респираторного тракта.

Высокая степень антагонистической активности по отношению к микрококку, комменсалу биотопа верхних дыхательных путей, является маркером носоглоточного происхождения изолятов, полученных из респираторных образцов.

Данные фенотипы были использованы нами [4] для дифференциальной диагностики инвазивных и неинвазивных штаммов оппортунистических микроорганизмов, выделенных из респираторных образцов.

Литература:

1. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Малышкин А. П. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1984. - № 2. - С. 27-29.

2. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Хуснутдинова , Л. М. Межбактериальные взаимодействия // Журн. микробиол. - 2003. - № 4. - С. 3-8.

3. Механизмы выживания бактерий / О. В. Бухарин, А. Л. Гинсбург, Ю. М. Романова, Г. И. Эль-Регистан. – М.: Медицина, 2005. – 367 с.

4. Холодок Г.Н., Морозова Н.В., Козлов В.К. Микробиологические и патогенетические аспекты внебольничной пневмонии у детей.-Хабаровск, «Арно», 2013.-190 с.