Т.В.Богданова, О.В.Бойко

ИЗГОТОВЛЕНИЕ АНТИГЕНА ИЗ DIROFILARIA IMMITIS ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ.

ГУ Астраханской области «Астраханская областная ветеринарная лаборатория», ФГУ «Астраханский Государственный университет»

Исходным материалом для получения антигена являлись половозрелые гельминты Dirofilaria immitis, извлеченные из правого желудочка у группы погибших собак. При жизни у некоторых собак наблюдалась амикрофиляремия. Извлеченных гельминтов измельчали на небольшие фрагменты ножницами, затем тщательно растирали с добавлением кварцевого песка в фарфоровой ступке при добавлении небольшого количества физиологического раствора (рН 7,2 - 7,4) в течение двух часов до получения однородной массы. Затем полученную суспензию замораживали при температуре – 4°С. В течение последующих трех суток суспензию извлекали из морозильной камеры и после некоторого оттаивания смесь тщательно растирали, а затем повторно подвергали заморозке. Эту процедуру повторяли 3 раза. Затем в полученную суспензию добавляли физиологический раствор из расчета 1:3 и экстрагировали путем встряхивания на шуттель-аппарате в течение четырех часов при комнатной температуре. Далее смесь центрифугировали при 3000 об/мин в 30 минут, осадок дважды промывали физиологическим раствором и центрифугировали также, порции экстрактов соединили. Полученный экстракт поместили для концентрирования в диализный мешок. Содержание белка после концентрации, измеренное при помощи рефрактометра составило – 15,2 г/л (15,2 мг/мл). Готовый антиген разлили по аликвотам и хранили в морозильной камере.

Иммунохимические методы предполагают получение и применение специфических антисывороток. Антисыворотки получали путем иммунизации кроликов, для этого использовали 10 серых кроликов в возрасте от 6 месяцев до года. На весь курс иммунизации (подкожные и внутримышечные инъекции) ушло 11,4 мл антиген-экстракта, что составило 173,28 мг белка.

Полученную от иммунизированных животных отстаивали при комнатной температуре не менее 2-х часов, затем центрифугировали. Полученную сыворотку разлили по аликвотам и хранили в морозильной камере при температуре - 15°С.

Далее проводили идентификацию антигенов. Принцип всех модификаций иммунодиффузного анализа заключается в том, что, антигены и антитела реагируют друг с другом, образуя видимый преципитат в том участке геля (иммунодиффузия по Ухтерлони), где их соотношение количественно оптимально. Для проведения анализа нами были приготовлены антиген-экстракты из сердца и легких, взятых у погибших животных, инвазированных дирофиляриями. При двойной радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони, в равномерном по толщине слое агарового геля пробиваются лунки, которые заполняют антигенами и антисывороткой. Далее происходит встречная диффузия, которая приводит к образованию преципитата. Иммунодиффузию проводили на трех предметных стеклах во влажной камере при температуре + 4°С. Через 24 часа считывали результаты реакции. Для заполнения лунок использовали цельный антиген и разведения – 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256, антиген-экстракты из легких и сердца и сыворотка крови инвазированных собак.

В результате данных исследований было установлено, что линия преципитации образовалась между цельным антигеном и антисывороткой, других линий преципитации нет, что доказывает отсутствие иммунологического родства между полученными нами антиген-экстрактами и сывороткой инвазированных животных. В связи с тем, что чувствительность иммунодиффузного метода не всегда может достаточно точно свидетельствовать об отсутствии реакции идентичности или же частичной идентичности между антигенами, следующим этапом, подтвердившим иммунологическую частоту и высокую специфичность нашего диагностикума, был иммуноэлектрофорез.

Таким образом, в результате проведенных испытаний, получено достоверное подтверждение высокой иммунологической частоты (отсутствие перекрестно реагирующих антител, проверенной в два этапа – иммунодиффузией по Ухтерлони, а затем, с использованием иммуноэлектрофореза) и эффективности предлагаемого нами метода. Только его достоверно подтвержденная иммунологическая чистота позволила нам рекомендовать его к широкому применению.