Биологические науки / 9. Биохимия и биофизика

К.т.н. Капустян А.И.

Одесская национальная академия пищевых технологий, Одесса

Получение и характеристика иммобилизованных форм

продуктов ферментолиза клеточных стенок

бактерий Lactobacillus aсidophilus

На сегодняшний день, ввиду возрождения клинического интереса к лечебно-профилактической нутритивной поддержке населения с иммунодефицитными состояниями, существует необходимость своевременного и адекватного обеспечения данной категории людей функциональными ингредиентами. Учитывая тот факт, что количество населения с расстройствами функций иммунной системы с каждым годом растет – задача создания ингредиентов для функциональных продуктов питания, обладающих иммунотропной активностью особенно актуальна.

Перспективными в этом отношении являются вещества мурамилдипептидного ряда. Мурамилдипептид (МДП) – компонент пептидогликанов клеточной стенки бактерий (рис.1), обладает мощным иммуностимулирующим действием. МДП и его производные вызывает адъювантный эффект, обладает способностью стимулировать антиинфекционную резистентность, противоопухолевый иммунитет, активировать иммунокомпетентные клетки [1-3]. Благодаря этим свойствам продукты деградации гликопептидов бактериальной клетки привлекают пристальное внимание исследователей как потенциальные компоненты лекарственных и лечебно-профилактических средств.

Рис. 1. Схематическое изображение структуры пептидогликана клеточной стенки.	Рис.2. Структура N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина (МДП)

Остов молекулы пептидогликана – дисахарид. Его образуют N-ацетил-глюкозамин и N-ацетилмурамовая кислота, соединённые через гликозидные связи. К молекуле N-ацетилмурамовой кислоты присоединяются олигопептиды, образующие боковые цепочки. Путем деструкции пептидогликана получают МДП (рис. 2).

В качестве источников веществ мурамилдипептидного ряда целесообразно использование грамположительных бактерий (например, род Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus и др.), доля пептидогликанов в клеточных стенках которых составляет до 70 % от сухой массы [5,7]. При этом доказано, что использование препаратов из целых микробных клеток является малоэффективными. В связи с этим существует необходимость деструкции бактериальных клеток, или создания синтетических аналогов МДП, с целью получения иммунотропных биологически активных веществ (БАВ), способных легче усваиваться и вступать в биохимические процессы, ускоряя ожидаемый иммунотропный эффект.

Разрушение клеточных стенок бактерий можно осуществлять с помощью различных физико-химических и биохимических методов [4]. По сравнению с химическими технологиями, биохимический (ферментативный) способ разрушения клеточных стенок бактерий обладает существенными преимуществами, главными из которых являются: доступность и простота проведения, незначительная энергозатратность и экологическая безопасность.

В качестве ферментов, как средств разрушения клеточной стенки, чаще всего используют протеазы (трипсин, химотрипсин, пепсин) или лизоцим.

Выбор именно этих ферментов аргументируется тем, что они гидролизуют специфические связи, которые присутствуют в составе биополимеров клеточной стенки бактерий. Так, лизоцим катализирует разрыв β-(1→4) гликозидных связей между N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислотой, а протеазы – пептидных связей между мурамовой кислотой в параллельных цепях (рис. 1, 2).

Однако было обнаружено, что МДП обладает достаточно высокой пирогенностью и быстро выводится из организма вследствие высокой гидрофильности [1]. В связи с этим целесообразной является модификация, или иммобилизация МДП и его производных для получения апирогенных веществ мурамилдипептиного ряда с возможной пролонгацией их действия.

В качестве матриц для иммобилизации продуктов деградации бактериальной стенки особого внимания заслуживают биополимерные полиэлектролитные комплексы (ПЭК), получаемые по принципу кооперативной электростатической самосборки. Включение биологически активных веществ в ПЭК обеспечивает их стабилизацию и пролонгацию действия. При выборе компонентов для таких систем, предпочтение отдается природным биополимерам, обладающим высокими функциональными свойствами, способностью к биодеградации, а также биосовместимостью с активной составляющей.

Цель настоящего исследования – получение и характеристика иммобилизованных в ПЭК хитозан-пектин продуктов ферментативной деградации клеточных стенок бактериальной массы Lactobacillus aсidophilus.

Ферментативный гидролиз проводили после предварительной инкубации водной суспензии бактериальной массы при 100 °С на протяжении 20 – 120 мин. Для приготовления ферментной композиции использовали 0,1 – 1,0 %-ные растворы трипсина и лизоцима в соотношении 1: 1. Гидролиз субстрата проводили при рН 7,5 и 37 °С, что соответствовало оптимумам действия ферментов [4].

Главным критерием эффективности разрушения клеточной стенки бактерий было получение максимального количества биологически активных низкомолекулярных продуктов гидролиза – аминокислот, низкомолекулярных пеп-тидов и аминосахаров.

Установлено, что максимальное накопление аминосахаров (0,09 мг/мл) и биологически активных пептидов (3,31 мг/мл) в ферментолизате имеет место в случае предварительной инкубации водной суспензии Lactobacillus aсidophilus при 100 °С в течении 60 мин, соотношении ферментная составляющая:субстрат 1:20 и длительности прцесса ферментолиза – 18 час.

Иммобилизацию полученного ферментолизата в ПЭК осуществляли путем последовательного сочетания растворов пектина (полианион, степень деметоксилирования 67 %), ферментолизата и хитозана (поликатион, степень ацетилирования 37 %). Концентрацию полисахаридов варьировали в интервале 0,25 – 2,0 %, ферментов – 0,25 – 1,0 %. Количество включенного ферментолизата определяли по разнице исходных азотсодержащих веществ ферментолизата и остаточным количеством их в надосадочной жидкости после комплексообразования (рис. 3).

С целью прогнозирования степени пролонгации высвобождения биологически активных веществ в составе ферментолизата из биополимерной полиэлектролитной матрицы, изучена динамика их диффузии во внешней раствор. Степень диффузии определяли путем фиксации содержания озотсодержащих веществ во внешнем растворе (рис. 4).

Рис. 3. Содержание азотсодержащих компонентов ферментолизата в трехкомпонентном комплексе хитозан-ферментолизат-пектин (концентрация полисахридов 0,5 %)	Рис. 4. Динамика диффузии азотсодержащих компонентов ферментолизата из ПЭК во внешней раствор

Как видно из рис. 3, практически полная иммобилизация продуктов деградации бактериальных стенок в комплекс имеет место при равном соотношении хитозан:пектин, что соответствует и комплементарному соотношению свободных функциональных групп в молекулах полисахаридов.

Зависимость приведенная на рис. 4 показывает, что имеет место тенденция замедления диффузии азотсодержащих компонентов ферментолизата из ПЭК во внешний раствор.

Таким образом, осуществлена деградация клеточных стенок бактериальной массы Lactobacillus aсidophilus ферментативным способом и получены низкомолекулярные продукты ферментолиза – петиды, аминокисоты, аминосахара. Проведена иммобилизация полученного ферментолизата в ПЭК хитозан-пектин, которая обеспечивает его пролонгированное высвобождение. Это позволяет прогнозировать использование полученных комплексов в качестве перспективных ингредиентов функциональных продуктов питания для населения с расстройствами иммунной системы.

Литература.

1. Пинегин Б.В. Препараты мурамилдипептидного ряда – иммунотропные лекарственные средства нового поколения / Б.В.Пинегин, Т.М. Андронова, М.И. Карсонова // INTERNATIONAL JOURNAL ON IMMUNOREHABILITATION, No 6, Р. – 34.

2. Сенченко С.П. Изучение состава препарата, полученного на основе гидролизата молочнокислых бактерий / С.П. Сенченко, В.А. Самойлов, Н.М. Гостищева, Г.В. Сеньчукова, М.В. Гаврилин // Хим. – фармац. журн. – Т.39, №3. – 2005. – С. 51-53

3. Пат. на корисну модель RU (11) 2304167 (13) C2 (51) МПК C12P21/00 (2006.01) Способ поучения гликопептидов и гликопептидный продукт, полученный этим способом, дя использования в медицине / Ермолаев Е, Д., Софронова О. В., Орлов Н. С., Полякова Л. Л., Пешкова Л. М.// Заявитель: Общество с ограниченной ответственностью "МЕДБИОФАРМ-БИОТЕХ". – Заявка: 2005128653/13, 15.09.2005; опубл. 20.03.2007

4. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение / Л.Я. Телишевская // Аграрная наука, Москва. – 2000.

5. Гаврилин В.М. Выбор оптимальных условий получения гидролизатов молочнокислых бактерий термокислотным способом / М.В. Гаврлин, Г.В. Сенчукова, С.П. Сенченко, В.А. Самойлов, Н.А. Гостищева // Хим. – фармац. журн. – Т.41, №2. – 2007. – С. 54-56

6. Самойлов В.А. Изучение состава препарата, полученного на основе гидролизатов молочнокислых бактерий / В.А. Самойлов, Н.А. Гостищева Г.В. Сенчукова, М.В.Гаврлин, С.П. Сенченко // Хим. – фармац. журн. – Т.39, №3. – 2005. – С. 51-53.

7. Гаранян Г.С. Химическое обоснований и биологическое исследование гидролизата на основе культур молочнокислых бактерий / Г.С.Гаранян, Р.А. Ханферян, Э.Т. Оганесян // Хим. – фармац. журн. – Т.44, №8. – 2010. – С. 46-49.