Биологические науки / 11. Биоинженерия и биоинформатика

д.б.н. Мельнов С.Б., Смольник Н.С., Снытков Е.В.

Международный государственный экологический университет

им. А.Д. Сахарова, Минск, Беларусь

Создание генетически модифицированных продуктов: современные технологии

До недавнего времени большинство выращиваемых в сельском хозяйстве трансгенных сортов растений содержали, в основном, либо ген устойчивости к гербицидам (71%), либо ген устойчивости к вредителям (18%) и лишь немногие (11%) – оба гена одновременно. Сейчас создаются генетически модифицированные растения, которые будут устойчивы не только к биотическим факторам (фитопатогенным вирусам, бактериям, грибам, нематодам и насекомым), но и к факторам абиотическим (засухе, заморозкам, засолению и т.д.). Эти генетически модифицированные растения будут также обладать пониженной аллергенностью и повышенной пищевой ценностью и усвояемостью. Достижение этих целей предполагает, что современные технологии создания трансгенных сортов растений будут базироваться на генетических конструкциях (вводимых в растительную клетку), включающих белоккодирующую последовательность, сигнальные элементы трансляции и транскрипции, а также маркерные гены. Наиболее важными из регуляторных последовательностей являются проксимальный участок промотора, связывающий РНК-полимеразу; участок, кодирующий 5'-конец мРНК, необходимый для связывания с рибосомой и инициации трансляции, и эукариотический сигнал полиаденилирования на З'-конце мРНК. Для эукариотических организмов эти конститутивные сигнальные элементы оказались высококонсервативными и достаточно универсальными, так что растительные клетки эффективно экспрессируют гены не только растений других видов, но и млекопитающих.

Однако для генов бактериального происхождения необходима замена их сигнальных элементов на соответствующие эукариотические. Для лучшей экспрессии гена на уровне трансляции мРНК желательно также приблизить набор кодонов к типичному. Обычно для этого посредством направленных точечных мутаций заменяют "редкие" кодоны на синонимичные "частые", что не сказывается на первичной структуре белка. В результате экспрессия гена может быть усилена до 300 раз. Минимальный промотор, связывающий РНК-полимеразу, как правило, недостаточен для обеспечения тканеспецифичного уровня транскрипции. Для усиления экспрессии встроенного гена используют полноразмерные промоторы, включающие энхансеры и/или факторзависимые цис-элементы. В результате подготовленный для трансформации ген, как правило, становится химерным, т.е. включает фрагменты ДНК двух разных видов.

Информация об известных к настоящему моменту промоторов достаточно разнообразна и постоянно пополняется. Конститутивные промоторы применяются для наработки существенных количеств продукта гена во всем растении. Для двудольных растений такими эффективными промоторами являются 35S-промотор вируса мозаичности цветной капусты (CaMV) и nos-промотор гена нопалин-синтазы агробактерий; для однодольных – промоторы гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (Adh) и гена актина 1 риса (Act). Помимо конститутивных, известно большое число специфических промоторов, которые активны лишь в отдельных органах, тканях или клетках, либо на отдельных стадиях онтогенеза растения. Примером может служить промотор гена пататина картофеля, работающий только в клубнях. Имеются также промоторы, активность которых проявляется в листьях, корнях, меристемах и других местах специфической локализации. Интенсивно изучаются и используются также индуцибельные промоторы, которые активируются лишь при определенных условиях. Многие из таких промоторов достаточно универсальны, например, некоторые промоторы генов теплового шока. В частности, промотор гена hsp70 из дрозофилы равно эффективен в клетках растений. Особый интерес представляют промоторы, индуцируемые низкомолекулярными химическими эффекторами, индукторами могут служить тетрациклин, дексаметазон, этанол, ионы меди и т.д. Эти промоторы очень важны для фундаментальных исследований трансгенных растений, позволяя четко дифференцировать первичные и вторичные эффекты изучаемого гена и тем самым прояснить его истинную биологическую функцию. Они перспективны также для биотехнологии, так как позволяют индуцировать экспрессию конкретного гена в заданный период.

Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами. Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения. Наиболее эффективная технология введения трансгенов в клетки растений – агробактериальная трансформация. Однако она имеет ограничения, связанные с кругом хозяев агробактерий. Специально отобранные штаммы Agrobacterium с широким кругом хозяев могут инфицировать приблизительно половину двудольных видов, а также некоторые из голосеменных. Тем не менее, совершенствование этого метода продолжается. В результате разработаны протоколы для агробактериальной трансформации риса. Выделены симбиотичные с растениями микроорганизмы, отличные от агробактерий (Rhizobium, Sinirhizobium, Mesorhizobium), которые после соответствующей генетической модификации способны к горизонтальному переносу генов. Для трансформации устойчивых к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК методом бомбардировки микрочастицами. Этим же методом можно трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы – хлоропласты и митохондрии. К другим методам относятся:

– метод введения ДНК в клетки растений с помощью биобалистики;

– баллистическая трансфекция, основанная на обстреле органов и тканей микрочастицами тяжелых металлов (золото, вольфрам), покрытых плазмидной ДНК. Микрочастицы проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в ядра клеток;

– комбинированный – агролистический метод трансформации, разработанный и успешно примененный в последнее время. При этом чужеродная ДНК вводится в ткани каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Вводимая ДНК включает как Т-ДНК вектор с целевым и маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности, поставленные под эукариотический промотор. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном, как при обычной агробактериальной трансформации.

После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.

Однако не стоит забывать, что создание трансгенных растений вне зависимости от способа, связано с риском получения гибридов с новым набором генов, которые могут неожиданно проявлять себя как в созданном организме, так и при взаимодействии с другими видами. Это, в свою очередь, может повлечь за собой привнесение в окружающую среду новых генотипов с невыясненными свойствами, а значит потенциально опасными для живых организмов.

Таким образом, считаем, что формирование единого реестра в области создания трансгенных растений, позволит проводить мониторирование разработок, облегчит проведение мета-анализа в указанной области, позволит прогнозировать свойства вновь создаваемых организмов и моделировать эффекты их взаимодействия с другими объектами. Все вышесказанное, при условии реализации, позволит повысить эффективность разработок в данной области и существенно снизить затраты на их реализацию.